逆病毒介導(dǎo)siRNA靶向BCRP-ABCG2逆轉(zhuǎn)藥物耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乳腺癌是一類(lèi)主要危害婦女健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率在美國(guó)、加拿大及北歐各國(guó)位居前列，我國(guó)乳腺癌發(fā)病率多年來(lái)一直呈上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡明顯提前。目前，預(yù)防和治療乳腺癌倍受關(guān)注，乳腺癌的治療目前仍以手術(shù)為主，輔以放射治療、化學(xué)治療、內(nèi)分泌治療等，其中化學(xué)治療對(duì)于乳腺癌手術(shù)前的微轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移、手術(shù)后的擴(kuò)散和復(fù)發(fā)，以及喪失手術(shù)機(jī)會(huì)的晚期乳腺癌的控制等具有不可替代的作用。但乳腺癌普遍存在的多藥耐受性(Multidrug resistance，MDR)

2、往往使其對(duì)化療藥物不敏感而導(dǎo)致化療失敗。因此，解決乳腺癌的多藥耐受性是改觀化療及綜合治療效果，提高患者生存率和生存質(zhì)量的關(guān)健問(wèn)題。 BCRP/ABCG2最早是在抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的乳腺癌耐藥細(xì)胞系中克隆，提示其與乳腺腫瘤耐藥的形成有著密不可分的關(guān)聯(lián)。目前，對(duì)于BCRP/ABCG2在乳腺癌中的表達(dá)所涉及的藥物耐受譜尚待詳盡，本研究擬利用已建立的BCRP/ABCG2體外表達(dá)細(xì)胞模型，并結(jié)合采用靈敏度、準(zhǔn)確度更高的熒光定量RT—PCR方

3、法和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)出的BCRP/ABCG2表達(dá)陽(yáng)性的乳腺癌組織標(biāo)本進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn)，可望篩選和完善BCRP/ABCG2介導(dǎo)的耐藥譜，進(jìn)一步闡述BCRP/ABCG2與耐受藥物的關(guān)系和作用機(jī)制，為臨床以BCRP/ABCG2表達(dá)檢測(cè)結(jié)果為評(píng)價(jià)指標(biāo)的乳腺癌化療藥物的優(yōu)化選擇提供有價(jià)值的資料。 研究腫瘤藥物耐受的目的是尋找耐藥形成的靶點(diǎn)，篩選特異性的逆轉(zhuǎn)劑，提高人群預(yù)防和臨床化療效果，降低藥物毒性。BCRP/ABCG2的耐藥逆轉(zhuǎn)研究已

4、有一些文獻(xiàn)報(bào)道，但臨床應(yīng)用的可行性低。因此，到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)成熟有效的針對(duì)BCRP/ABCG2的逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐受的方法。 至首次報(bào)道RNA干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象以來(lái)，雖然多數(shù)核酸內(nèi)切酶復(fù)合體(RNA—induced silencing complex，RISC)蛋白成份尚未闡明，但RNAi在不同種屬生物細(xì)胞內(nèi)降解mRNA的高效率、高特異性，使之可能成為研究基因的功能與疾病基因治療的新型生物技

5、術(shù)。迄今為止的研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)建感染率高、穩(wěn)定表達(dá)的逆病毒表達(dá)載體在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)siRNA最具優(yōu)勢(shì)。為了進(jìn)一步探討逆轉(zhuǎn)BCRP/ABCG2介導(dǎo)的乳腺癌藥物耐受的作用和方法，本研究將以BCRP/ABCG2的ATP結(jié)合盒式區(qū)域?yàn)榘?，設(shè)計(jì)多條表達(dá)RNAi的DNA序列并重組構(gòu)建至逆病毒載體中，經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)開(kāi)展逆轉(zhuǎn)BCRP/ABCG2表達(dá)與功能的RNA干擾研究，不僅將獲得高效抑制BCRP/ABCG2功能的靶向ATP結(jié)合區(qū)的RNA干擾序列，為提高乳腺癌等

6、惡性腫瘤化療敏感性創(chuàng)立新方法，而且將為惡性腫瘤的基因治療和基因功能研究開(kāi)拓新思路。 方法： 1.運(yùn)用藥物敏感性實(shí)驗(yàn)(MTT法)來(lái)初步篩選對(duì)BCRP/ABCG2表達(dá)的模型細(xì)胞耐受的抗腫瘤藥物；運(yùn)用高效液相色譜法進(jìn)一步證實(shí)。 2.取臨床乳腺癌手術(shù)切除組織，采用熒光定量RT—PCR方法和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)BCRP/ABCG2的表達(dá)；取30-40例BCRP/ABCG2表達(dá)陽(yáng)性的乳腺癌手術(shù)切除組織，MTT法驗(yàn)證并分析臨床腫

7、瘤組織中BCRP/ABCG2的表達(dá)與耐受藥物的相關(guān)關(guān)系。 3.利用表達(dá)小分子發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA的逆病毒重組系統(tǒng)，針對(duì)BCRP/ABCG2基因ATP結(jié)合盒(ATP—binding cassette，ABC)結(jié)構(gòu)區(qū)域，合成3對(duì)靶序列并構(gòu)建3個(gè)pLenti6/BCRPsi重組子，即pLenti6/BCRP1i、pLenti6/BCRP2i、pLenti6/BCRP3i，經(jīng)病毒包裝細(xì)胞(293FT)獲得各pLenti6/BCRPsi逆轉(zhuǎn)錄病

8、毒。 4.將含pLenti6/BCRPsi的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染體外培養(yǎng)的內(nèi)源性高表達(dá)BCRP/ABCG2的人類(lèi)絨毛膜癌細(xì)胞系—JAR細(xì)胞，熒光定量RT—PCR、Western blot法及免疫熒光法檢測(cè)JAR細(xì)胞中BCRP/ABCG2表達(dá)變化，預(yù)期篩選出含干擾效果較好的pLenti6/BCRPsi的逆病毒(V—BCRPi)。 5.采用藥物敏感性實(shí)驗(yàn)(MTT法)和流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)V—BCRPi逆轉(zhuǎn)JAR細(xì)胞對(duì)藥物的耐受效果。

9、 6.將JAR細(xì)胞行裸鼠皮下注射接種，培養(yǎng)建立荷JAR細(xì)胞瘤的裸鼠；用V—BCRPi行瘤體注射荷瘤裸鼠后，免疫組織化學(xué)法、熒光定量RT—PCR和Western blot檢測(cè)腫瘤組織BCRP/ABCG2的表達(dá)；腹腔注射BCRP/ABCG2耐受的藥物后，測(cè)量瘤體體積和重量變化及原位雜交技術(shù)檢測(cè)瘤組織細(xì)胞凋亡狀況。 結(jié)果： 1.對(duì)BCRP/ABCG2可誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞模型經(jīng)細(xì)胞毒性試驗(yàn)(MTT法)分析得出：隨著B(niǎo)CRP/AB

10、CG2的表達(dá)增高，細(xì)胞對(duì)5-氟脲嘧啶(5-Fu)、甲氨蝶呤(MTX)、多柔比星(Dox)、吡柔比星(Pir)、依托泊苷(Eto)、米托蒽醌(Mit)等藥物的耐藥指數(shù)增高(P<0.05，n=3)，而對(duì)5-Fu的耐藥指數(shù)由1至高達(dá)10.58。其對(duì)如紫杉醇(Pac)、順鉑(Cis)、長(zhǎng)春堿(Vin)、絲裂霉素(MMC)、長(zhǎng)春地辛(VDS)等藥物均敏感。結(jié)果提示BCRP/ABCG2的表達(dá)能介導(dǎo)5-Fu的藥物耐受。 2.經(jīng)高效液相色譜法分

11、析，不同BCRP/ABCG2表達(dá)量的細(xì)胞其胞內(nèi)5-Fu濃度與BCRP/ABCG2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=—0.885，P<0.05，n=3)。而B(niǎo)CRP/ABCG2的特異性抑制劑—Ko143能顯著提高胞內(nèi)5-Fu的濃度(P<0.01)。經(jīng)此功能檢測(cè)進(jìn)一步表明BCRP/ABCG2的表達(dá)能介導(dǎo)5-Fu的藥物耐受。 3.經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR和免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)了140例臨床乳腺癌手術(shù)標(biāo)本中有47例標(biāo)本BCRP/ABCG2表達(dá)陽(yáng)性

12、，陽(yáng)性率達(dá)到33％；隨后經(jīng)MTT法檢測(cè)了47例陽(yáng)性BCRP/ABCG2表達(dá)的乳腺癌標(biāo)本對(duì)5-Fu的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同BCRP/ABCG2表達(dá)量的乳腺癌標(biāo)本對(duì)5-Fu的耐受指數(shù)從7達(dá)到12，具有高度相關(guān)性(r2=0.8124，P<0.01)。研究結(jié)果不僅進(jìn)一步證實(shí)了在臨床腫瘤標(biāo)本中BCRP/ABCG2能介導(dǎo)5-Fu的耐受，而且能為BCRP/ABCG2表達(dá)陽(yáng)性的臨床腫瘤標(biāo)本化療方案的優(yōu)化提供可靠的科學(xué)依據(jù)。 4.采用逆病毒RNAi

13、表達(dá)系統(tǒng)(Block—iT Lentiviral RNAi Expression System)，構(gòu)建了針對(duì)ATP結(jié)合區(qū)(第六外顯子的207位、745位、939位等起始點(diǎn)20個(gè)bp)的3個(gè)逆病毒pENTER/vector重組子，經(jīng)序列測(cè)定并Blast比較得以證實(shí)均獲得陽(yáng)性重組子，再將陽(yáng)性重組子分別經(jīng)酶法重組至病毒表達(dá)載體pLenti/vector上，獲得3個(gè)pLenti6/BCRPsi重組子。 5.隨后將3個(gè)pLenti6/BC

14、RPsi重組子分別經(jīng)包裝細(xì)胞(293FT)包裝成感染病毒，并利用BCRP/ABCG2內(nèi)源性高表達(dá)的人類(lèi)絨毛膜癌細(xì)胞系(JAR)作為受試感染細(xì)胞，經(jīng)熒光定量RT—PCR、Western blot雜交和免疫熒光細(xì)胞染色等進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)，并經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞毒性試驗(yàn)(MTT法)等檢測(cè)pLenti6/BCRPsi重組子逆轉(zhuǎn)JAR細(xì)胞對(duì)藥物的耐受效果，結(jié)果表明pLenti6/BCRP3i抑制BCRP/ABCG2的表達(dá)效果較好，且pLenti6/BC

15、RP3i不僅能顯著提高M(jìn)IT在JAR細(xì)胞內(nèi)的存留量，顯示出其能有效地抑制BCRP/ABCG2的功能，而且能顯著提高JAR細(xì)胞對(duì)耐受藥物5-Fu的敏感性(P<0.01)，顯示出較好的藥物增敏效果，由此，成功地篩選到了干擾BCRP/ABCG2表達(dá)與逆轉(zhuǎn)功能效果最好的逆病毒重組子并命名為V—BCRPi。 6.培養(yǎng)JAR細(xì)胞并制備成1x106個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，以0.2ml/只接種于裸鼠右后背皮下10天左右，建立了荷JAR細(xì)胞瘤的裸鼠

16、，并經(jīng)瘤體多點(diǎn)注射重組逆病毒V—BCRPi及腹腔注射10xIC50濃度的5-Fu藥物，經(jīng)觀察14天后，經(jīng)瘤體體積和體重的變化分析、熒光定量RT—PCR、Western blot、免疫組織化學(xué)、原位凋亡檢測(cè)等方法分析，JAR細(xì)胞瘤組織中BCRP/ABCG2的表達(dá)能被V—BCRPi有效抑制并且V—BCRPi能增強(qiáng)瘤組織細(xì)胞對(duì)5-Fu藥物的敏感性，提高藥物誘導(dǎo)瘤細(xì)胞促凋亡的效果。 結(jié)論： 1.率先研究得出BCRP/ABCG2能