siRNA靶向干擾VEGF-C對小鼠乳腺癌腫瘤微環(huán)境的影響.pdf

1、目的：乳腺癌組織內的微環(huán)境是腫瘤細胞產生、增殖、侵襲和轉移的必要物質基礎。血管內皮生長因子C(VEGF-C)能夠在腫瘤微環(huán)境中引起微淋巴管的生成，參與腫瘤細胞的轉移以及誘導免疫耐受，然而VEGF-C對乳腺癌腫瘤微環(huán)境的作用機制尚未完全明確。本研究以小鼠乳腺癌4T1細胞和樹突細胞為切入點，采用RNAi方法干擾VEGF-C表達，通過體外和體內試驗，從分子、細胞及動物整體水平探討VEGF-C與腫瘤微環(huán)境之間的關系及其作用機制。
　　方法

2、：⑴體外實驗：設計、化學合成三對靶向小鼠 VEGF-C的 siRNA，在細胞水平應用轉染試劑將三對siRNA分別轉染到4T1細胞內，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，提取出細胞內的mRNA與蛋白，使用RT-PCR與Western blot方法檢測VEGF-C的表達水平，篩選出沉默效率最高的一對siRNA；隨后在體外培養(yǎng)小鼠乳腺癌4T1細胞，采用 MTT比色法、Hochest33258熒光染色、流式細胞術及劃痕實驗檢測靶向干擾VEGF-C對4T1小鼠乳

3、腺癌細胞的增殖、遷徙和凋亡的影響；應用RT-PCR、ELISA與Western blotting方法檢測靶向干擾VEGF-C對于4T1細胞CCR7、CCL21、VEGFR-3、KLF-2與survivin的表達水平、AKT蛋白的磷酸化水平以及Caspase-3的活化水平的影響；體外培養(yǎng)從小鼠股骨中分離培養(yǎng)的樹突狀細胞，通過脂質體轉染siRNA靶向干擾小鼠樹突狀細胞的VEGF-C表達，應用ELISA、RT-PCR、Western blot

4、ting方法檢測鼠DC細胞VEGF-C、VEGFR-3、KLF-2與survivin的表達水平、AKT蛋白的磷酸化水平以及Caspase-3的活化水平；應用流式細胞術與MLR技術檢測小鼠樹突狀細胞表型、凋亡與刺激同種異型淋巴細胞的能力變化。⑵體內實驗：用4T1細胞接種于Balb/c小鼠的皮下，建立荷瘤動物模型，進行瘤內藥物注射，觀察靶向干擾VEGF-C對腫瘤生長和轉移的影響。瘤內注射結束后，處死小鼠，TUNEL染色檢測腫瘤內細胞凋亡狀況

5、；ELISA法檢測腫瘤組織中VEGF-C與CCL21蛋白的表達；流式細胞術檢測瘤內侵潤DC與Treg細胞的分布狀況；應用免疫組化法與ELISA方法檢測瘤組織內VEGF-C、pAKT、KLF-2、Survivin和VEGFR-3蛋白的表達以及微淋巴管密度，探討靶向干擾VEGF-C的體內抗腫瘤作用及其對腫瘤微環(huán)境的影響機制。
　　結果：①體外實驗：RT-PCR與Western blot方法檢測結果顯示設計合成的三對siRNA中，siV

6、2轉染對4T1細胞的VEGF-C沉默效率最高；100nM濃度的siV2轉染4T1細胞48小時后，RT-PCR及Western blot結果顯示4T1細胞中的VEGF-C、VEGFR-3、pAKT、KLF-2及Survivin的mRNA與蛋白表達均顯著下降而活化Caspase-3蛋白表達顯著增加；ELISA結果顯示4T1細胞上清中VEGF-C與CCL21濃度明顯降低；MTT結果顯示4T1細胞增殖顯著降低；Hochest33258染色結果顯

7、示4T1細胞出現典型的凋亡形態(tài)學改變；流式細胞術結果顯示4T1細胞的凋亡率顯著增加而CCR7表達顯著下調；細胞遷徙實驗顯示4T1細胞的遷移能力顯著降低。siV2轉染小鼠樹突狀細胞48小時后，ELISA結果顯示小鼠DC培養(yǎng)上清中VEGF-C濃度明顯降低；流式細胞術結果顯示小鼠DC的凋亡率明顯增加；RT-PCR及Western blot結果顯示小鼠DC的VEGF-C、VEGFR-3、pAKT、KLF-2及Survivin表達均顯著降低而活化

8、Caspase-3蛋白表達明顯增加。LPS刺激24小時后，經流式細胞術檢測，結果顯示siV2轉染小鼠DC的CD86、I-Ad與CCR7表達明顯低于對照組,而CD80表達卻無明顯差異;MLR結果顯示siV2轉染小鼠DC的刺激同種異型淋巴細胞的能力顯著降低。②體內實驗：動物實驗結果顯示與空白組及平行對照組相比較：siV2瘤內注射能夠明顯抑制移植瘤的增長和肺轉移；TUNEL染色結果顯示腫瘤組織中凋亡細胞明顯增多；免疫組化結果顯示腫瘤組織內VE

9、GF-C、pAKT、KLF-2、Survivin及VEGFR3蛋白表達與微淋巴管密度明顯降低；ELISA結果顯示腫瘤組織中VEGF-C與CCL21表達明顯降低；流式細胞術結果顯示腫瘤內浸潤的樹突狀細胞及Treg細胞數目明顯減少，腫瘤細胞與浸潤樹突細胞的CCR7表達均明顯降低，浸潤樹突細胞的CD80、CD86、I-Ad表達組間無明顯差異，但表達率均低于成熟DC。
　　結論：VEGF-C干擾可以在體內外下調4T1細胞的CCR7與CCL

10、21表達、抑制4T1細胞的增殖、促進4T1細胞的凋亡；VEGF-C干擾可以在體外抑制小鼠樹突狀細胞的成熟、促進小鼠樹突狀細胞的凋亡、在體內外水平降低小鼠樹突狀細胞CCR7的表達；VEGF-C干擾能夠在體內水平抑制小鼠乳腺癌腫瘤的增長和肺轉移，并能夠降低腫瘤微環(huán)境中Treg與幼稚DC的數目及微淋巴管密度。該作用機制可能與VEGF-C表達沉默后，VEGFR-3表達降低，胞內PI3K/AKT信號通路中的AKT磷酸化水平降低，以及凋亡抑制蛋白s