慢病毒介導的siRNA干擾乳腺癌MCF-7細胞MIF因子對VEGF-C表達的影響及作用機制.pdf

1、目的：構(gòu)建具有高轉(zhuǎn)染效率的慢病毒載體，探討慢病毒介導的siRNA對乳腺癌MCF-7細胞中巨噬細胞移動抑制因子（ macrophage migration inhibitory factor,MIF）的下調(diào)作用并建立穩(wěn)定低表達MIF因子的乳腺癌細胞株。研究乳腺癌細胞中MIF因子的表達對血管內(nèi)皮生長因子-C（vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C）分泌的影響及作用機制。
　　方法：⑴構(gòu)建

2、攜帶干擾MIF表達的siRNA的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細胞，應用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后乳腺癌細胞熒光表達情況及細胞狀態(tài)。⑵應用實時熒光定量 PCR（ RT-qPCR)與免疫印記雜交技術(shù)(Western bolt)檢測siRNA干擾后MCF-7細胞MIF因子mRNA及蛋白表達變化。⑶應用RT-qPCR技術(shù)及酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測下調(diào)MIF因子后，MCF-7細胞VEGF-C的mRNA表達變化及細胞培養(yǎng)上清中VEGF-

3、C分泌情況。⑷應用Western blot檢測MIF因子沉默前后，MAPK信號通路中p38、P-p38、p44/42、P-p44/42的蛋白表達變化。
　　結(jié)果：構(gòu)建的攜帶siRNA的慢病毒載體對人乳腺癌MCF-7細胞轉(zhuǎn)染效率超過80％，慢病毒轉(zhuǎn)染細胞72小時后細胞內(nèi)熒光表達量達到最高水平并趨于穩(wěn)定。所構(gòu)建的慢病毒攜帶的siRNA能有效阻斷乳腺癌MCF-7細胞中MIF因子mRNA和蛋白的表達。MIF表達降低的乳腺癌細胞中，VEGF