TAG-1對(duì)U251細(xì)胞活力的影響及相關(guān)基因調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)腫瘤最常見(jiàn)的腫瘤,有報(bào)道其每年發(fā)病率高達(dá)7/10萬(wàn)人,占到了70歲之前因患癌癥病人死亡的7％。該類(lèi)腫瘤特征是進(jìn)行性生長(zhǎng),廣泛血管生成,復(fù)發(fā),彌散侵犯周?chē)M織并導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙。目前對(duì)于膠質(zhì)瘤患者多采取綜合治療,包括手術(shù)切除、放療和化療。在過(guò)去的20多年,神經(jīng)外科技術(shù)、放療、化療雖然取得了很大進(jìn)展,但對(duì)于膠質(zhì)瘤仍然是姑息性治療和處理,并且

2、預(yù)后十分差。有報(bào)道稱,膠質(zhì)瘤病人6月存活率42.4％,1年存活率17.7％,2年存活率僅為3.3％。因此,仍需努力尋求新的治療方案。深入探求膠質(zhì)瘤的發(fā)病基因機(jī)制和分子生物學(xué)特征而尋求新的治療方法成為醫(yī)學(xué)研究的必要。p53被認(rèn)為是基因組的管家。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)部或外部的應(yīng)急刺激時(shí)(譬如DNA損傷,炎癥,缺氧等),p53即開(kāi)始激活并轉(zhuǎn)錄通過(guò)控制細(xì)胞周期、衰老或促進(jìn)細(xì)胞凋亡而阻止細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化。而且促進(jìn)細(xì)胞凋亡是p53抑制腫瘤的重要作用。表皮生長(zhǎng)

3、因子受體(epidermal growthfactor receptor,EGFR)是一種跨膜酪氨酸激酶受體,屬于酪氨酸激酶受體ErbB家族,激活的EGFR可通過(guò)Ras和PI3K兩種信號(hào)途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖。大量研究表明EGFR信號(hào)途徑在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,并且通過(guò)阻滯EGFR信號(hào)途徑是治療膠質(zhì)瘤的新策略,有用單克隆抗體[如曲妥單抗(Trastuzumab)]細(xì)胞表面封鎖或用小分子藥物(譬如ZD-和OS-774)封鎖細(xì)胞內(nèi)信

4、號(hào)途徑等諸多方法,為膠質(zhì)瘤患者帶來(lái)了新希望。本研究以腫瘤抑制因子p53和表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR為切入點(diǎn),結(jié)合本團(tuán)隊(duì)新發(fā)現(xiàn)的一種與AD發(fā)病相關(guān)的信號(hào)通路,探討膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制及尋求增強(qiáng)治療效果的新途徑。
　　 有研究認(rèn)為(http://baike.qiji.cn/Detailes/5102.html),緩慢生長(zhǎng)且病程較久的腦腫瘤可以誘發(fā)阿爾茨海默病(Alzheimer disease AD,又稱老年癡呆),其與腫瘤類(lèi)型及發(fā)生部位密

5、切相關(guān),一般認(rèn)為海馬區(qū)是AD病變的重要部位,如若腦腫瘤生長(zhǎng)在海馬附近,且腫瘤生長(zhǎng)速度快、體積大,就更易引起AD；另一方面,臨床上值得注意的現(xiàn)象是,已患AD的病例觀察到很少并發(fā)腦腫瘤,此現(xiàn)象提示:與AD發(fā)生機(jī)制相關(guān)的信號(hào)通路是否參與抑制腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展?眾所周知,AD的主要病理標(biāo)志之一是β淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)酶解生成的細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)沉積

6、,而伴隨Aβ的生成,APP同時(shí)釋放其羧基段的細(xì)胞內(nèi)末端(APP intracellualr domain,AICD)。已有研究表明,AICD通過(guò)APP/AICD/p53或APP/AICD/EGFR(epidermal growth factorreceptor,EGFR)等信號(hào)途徑,可以增強(qiáng)細(xì)胞凋亡和發(fā)揮腫瘤抑制效應(yīng)；特別是本團(tuán)隊(duì)最新發(fā)現(xiàn),細(xì)胞粘連分子TAG-1(transient axonal glycoprotein-1,瞬變軸突糖

7、蛋白1)可作為APP的配體、增強(qiáng)APP胞內(nèi)段AICD的釋放并參與AD的發(fā)生發(fā)展(研究結(jié)果已發(fā)表在《Nature Cell Biology》,2008.10(3):283-94),那么與TAG-1誘發(fā)信號(hào)通路相關(guān)的某些信號(hào)途徑(如TAG-1/APP/AICD/p53或TAG-1/APP/AICD/EGFR)是否也與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有聯(lián)系?TAG-1啟動(dòng)的這些信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用怎樣?目前尚未得知。
　　 本研究以抑

8、癌基因p53和EGFR為切入點(diǎn),以TAG-1/APP/AICD/p53及TAG-1/APP/AICD/EGFR信號(hào)通路為主線,探討TAG-1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞的活力及其對(duì)AICD,p53和EGFR基因表達(dá)的影響,以探尋膠質(zhì)瘤治療的可能新途徑。
　　 目的：研究TAG-1對(duì)U251細(xì)胞生長(zhǎng)活力、AICD、p53和EGFR基因表達(dá)變化的影響,從分子信號(hào)途徑尋求治療臨床膠質(zhì)瘤的新措施。
　　 方法：以MTT法檢測(cè)不同濃

9、度TAG-1對(duì)U251細(xì)胞活力影響；免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法觀察U251細(xì)胞APP的表達(dá)情況及APP在U251細(xì)胞膜分布；TUNEL法從形態(tài)學(xué)上檢測(cè)TAG-1對(duì)U251細(xì)胞凋亡變化的影響；Real-time PCR檢測(cè)TAG-1對(duì)U251細(xì)胞AICD、p53和EGFR基因表達(dá)的調(diào)控及變化。
　　 結(jié)果：APP廣泛表達(dá)于U251細(xì)胞膜和樹(shù)突,而胞體內(nèi)APP熒光染色不是十分強(qiáng)烈；經(jīng)不同濃度的TAG-1作用一定時(shí)間后,TAG-1沒(méi)有抑制U2

10、51細(xì)胞的生長(zhǎng),相反表現(xiàn)出一定的促生長(zhǎng)效應(yīng),且各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.429)；在TAG-1濃度為10 μ g/ml時(shí),U251細(xì)胞通過(guò)TUNENL形態(tài)學(xué)凋亡檢測(cè)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的凋亡細(xì)胞；而在10 μ g/ml TAG-1的作用下,與對(duì)照組(0 μ g/ml)相比,AICD、p53和EGFR基因表達(dá)都有不同程度的增加。
　　 討論：與我們預(yù)料的不同,實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示TAG-1沒(méi)有抑制U251細(xì)胞生長(zhǎng),反而在一組實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)MT

11、T檢測(cè)顯示,TAG-1可能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；利用TUNEL凋亡檢測(cè)方法檢測(cè)經(jīng)TAG-1作用的U251細(xì)胞,亦沒(méi)有觀察到凋亡細(xì)胞；且相對(duì)于對(duì)照組(0 μ g/ml of TAG-1),p53、EGFR、AICD等基因都有增高。以上提示,我們推測(cè)TAG-1可能通過(guò)其他不同的信號(hào)途徑發(fā)揮作用而誘導(dǎo)EGFR過(guò)量表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)U251細(xì)胞增殖；p53基因的表達(dá)上調(diào)可能為腫瘤細(xì)胞增殖的應(yīng)急反應(yīng),也就是說(shuō),過(guò)量增殖的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)了p53基因表達(dá)上調(diào)。因此

12、,阻止TAG-1信號(hào)途徑可能是治療腫瘤的措施之一。本實(shí)驗(yàn)首次報(bào)道TAG-1對(duì)U251細(xì)胞AICD、p53、EGFR基因的作用,提示TAG-1未有通過(guò)TAG-1/APP/AICD/p53或TAG-1/APP/AICD/EGFR信號(hào)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但TAG-1在膠質(zhì)瘤增殖中可能發(fā)揮重要作用?？梢岳斫鉃?分子信號(hào)途徑不是直線式的,一種細(xì)胞促發(fā)物可能激活不同的信號(hào)網(wǎng)絡(luò),并且在多水平上發(fā)揮作用；且任何一種分子的作用都依賴于細(xì)胞類(lèi)型和細(xì)胞狀態(tài),受

13、細(xì)胞微環(huán)境中其他因素的影響,所以用不同的刺激物或不同的細(xì)胞系針對(duì)同一信號(hào)途徑亦會(huì)得到不同的結(jié)果和現(xiàn)象。有關(guān)TAG-1影響EGFR基因表達(dá)的機(jī)制及TAG-1/APP等信號(hào)途徑在細(xì)胞增殖中的作用機(jī)制和其在膠質(zhì)瘤治療中的意義尚需下一步深入研究。
　　 結(jié)論：1、與TAG-1并未通過(guò)TAG-1/APP/AICD/p53或TAG-1/APP/AICD/EGFR等信號(hào)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)和增殖,相反,TAG-1可能通過(guò)誘導(dǎo)其他信