TAG-1對U251細胞活力的影響及相關基因調(diào)節(jié)機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)腫瘤最常見的腫瘤,有報道其每年發(fā)病率高達7/10萬人,占到了70歲之前因患癌癥病人死亡的7％。該類腫瘤特征是進行性生長,廣泛血管生成,復發(fā),彌散侵犯周圍組織并導致神經(jīng)功能障礙。目前對于膠質瘤患者多采取綜合治療,包括手術切除、放療和化療。在過去的20多年,神經(jīng)外科技術、放療、化療雖然取得了很大進展,但對于膠質瘤仍然是姑息性治療和處理,并且

2、預后十分差。有報道稱,膠質瘤病人6月存活率42.4％,1年存活率17.7％,2年存活率僅為3.3％。因此,仍需努力尋求新的治療方案。深入探求膠質瘤的發(fā)病基因機制和分子生物學特征而尋求新的治療方法成為醫(yī)學研究的必要。p53被認為是基因組的管家。當細胞受到內(nèi)部或外部的應急刺激時(譬如DNA損傷,炎癥,缺氧等),p53即開始激活并轉錄通過控制細胞周期、衰老或促進細胞凋亡而阻止細胞向惡性轉化。而且促進細胞凋亡是p53抑制腫瘤的重要作用。表皮生長

3、因子受體(epidermal growthfactor receptor,EGFR)是一種跨膜酪氨酸激酶受體,屬于酪氨酸激酶受體ErbB家族,激活的EGFR可通過Ras和PI3K兩種信號途徑促進細胞增殖。大量研究表明EGFR信號途徑在膠質瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關鍵作用,并且通過阻滯EGFR信號途徑是治療膠質瘤的新策略,有用單克隆抗體[如曲妥單抗(Trastuzumab)]細胞表面封鎖或用小分子藥物(譬如ZD-和OS-774)封鎖細胞內(nèi)信

4、號途徑等諸多方法,為膠質瘤患者帶來了新希望。本研究以腫瘤抑制因子p53和表皮生長因子受體EGFR為切入點,結合本團隊新發(fā)現(xiàn)的一種與AD發(fā)病相關的信號通路,探討膠質瘤發(fā)病機制及尋求增強治療效果的新途徑。
　　 有研究認為(http://baike.qiji.cn/Detailes/5102.html),緩慢生長且病程較久的腦腫瘤可以誘發(fā)阿爾茨海默病(Alzheimer disease AD,又稱老年癡呆),其與腫瘤類型及發(fā)生部位密

5、切相關,一般認為海馬區(qū)是AD病變的重要部位,如若腦腫瘤生長在海馬附近,且腫瘤生長速度快、體積大,就更易引起AD；另一方面,臨床上值得注意的現(xiàn)象是,已患AD的病例觀察到很少并發(fā)腦腫瘤,此現(xiàn)象提示:與AD發(fā)生機制相關的信號通路是否參與抑制腦膠質瘤發(fā)生發(fā)展?眾所周知,AD的主要病理標志之一是β淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)酶解生成的細胞外β淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)沉積

6、,而伴隨Aβ的生成,APP同時釋放其羧基段的細胞內(nèi)末端(APP intracellualr domain,AICD)。已有研究表明,AICD通過APP/AICD/p53或APP/AICD/EGFR(epidermal growth factorreceptor,EGFR)等信號途徑,可以增強細胞凋亡和發(fā)揮腫瘤抑制效應；特別是本團隊最新發(fā)現(xiàn),細胞粘連分子TAG-1(transient axonal glycoprotein-1,瞬變軸突糖

7、蛋白1)可作為APP的配體、增強APP胞內(nèi)段AICD的釋放并參與AD的發(fā)生發(fā)展(研究結果已發(fā)表在《Nature Cell Biology》,2008.10(3):283-94),那么與TAG-1誘發(fā)信號通路相關的某些信號途徑(如TAG-1/APP/AICD/p53或TAG-1/APP/AICD/EGFR)是否也與膠質瘤的發(fā)生發(fā)展有聯(lián)系?TAG-1啟動的這些信號通路在膠質瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用怎樣?目前尚未得知。
　　 本研究以抑

8、癌基因p53和EGFR為切入點,以TAG-1/APP/AICD/p53及TAG-1/APP/AICD/EGFR信號通路為主線,探討TAG-1對膠質瘤細胞系U251細胞的活力及其對AICD,p53和EGFR基因表達的影響,以探尋膠質瘤治療的可能新途徑。
　　 目的：研究TAG-1對U251細胞生長活力、AICD、p53和EGFR基因表達變化的影響,從分子信號途徑尋求治療臨床膠質瘤的新措施。
　　 方法：以MTT法檢測不同濃

9、度TAG-1對U251細胞活力影響；免疫熒光細胞化學法觀察U251細胞APP的表達情況及APP在U251細胞膜分布；TUNEL法從形態(tài)學上檢測TAG-1對U251細胞凋亡變化的影響；Real-time PCR檢測TAG-1對U251細胞AICD、p53和EGFR基因表達的調(diào)控及變化。
　　 結果：APP廣泛表達于U251細胞膜和樹突,而胞體內(nèi)APP熒光染色不是十分強烈；經(jīng)不同濃度的TAG-1作用一定時間后,TAG-1沒有抑制U2

10、51細胞的生長,相反表現(xiàn)出一定的促生長效應,且各組間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.429)；在TAG-1濃度為10 μ g/ml時,U251細胞通過TUNENL形態(tài)學凋亡檢測沒有發(fā)現(xiàn)明顯的凋亡細胞；而在10 μ g/ml TAG-1的作用下,與對照組(0 μ g/ml)相比,AICD、p53和EGFR基因表達都有不同程度的增加。
　　 討論：與我們預料的不同,實驗結果提示TAG-1沒有抑制U251細胞生長,反而在一組實驗中,通過MT

11、T檢測顯示,TAG-1可能促進細胞生長；利用TUNEL凋亡檢測方法檢測經(jīng)TAG-1作用的U251細胞,亦沒有觀察到凋亡細胞；且相對于對照組(0 μ g/ml of TAG-1),p53、EGFR、AICD等基因都有增高。以上提示,我們推測TAG-1可能通過其他不同的信號途徑發(fā)揮作用而誘導EGFR過量表達,進而促進U251細胞增殖；p53基因的表達上調(diào)可能為腫瘤細胞增殖的應急反應,也就是說,過量增殖的腫瘤細胞誘導了p53基因表達上調(diào)。因此

12、,阻止TAG-1信號途徑可能是治療腫瘤的措施之一。本實驗首次報道TAG-1對U251細胞AICD、p53、EGFR基因的作用,提示TAG-1未有通過TAG-1/APP/AICD/p53或TAG-1/APP/AICD/EGFR信號途徑誘導細胞凋亡,但TAG-1在膠質瘤增殖中可能發(fā)揮重要作用。可以理解為:分子信號途徑不是直線式的,一種細胞促發(fā)物可能激活不同的信號網(wǎng)絡,并且在多水平上發(fā)揮作用；且任何一種分子的作用都依賴于細胞類型和細胞狀態(tài),受

13、細胞微環(huán)境中其他因素的影響,所以用不同的刺激物或不同的細胞系針對同一信號途徑亦會得到不同的結果和現(xiàn)象。有關TAG-1影響EGFR基因表達的機制及TAG-1/APP等信號途徑在細胞增殖中的作用機制和其在膠質瘤治療中的意義尚需下一步深入研究。
　　 結論：1、與TAG-1并未通過TAG-1/APP/AICD/p53或TAG-1/APP/AICD/EGFR等信號途徑誘導細胞凋亡而抑制膠質瘤生長和增殖,相反,TAG-1可能通過誘導其他信