（一）ROS調(diào)節(jié)大鼠血管中膜干細胞向血管平滑肌細胞分化機制的研究（二）Irisin通過ERK信號通路促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖并部分抑制高糖誘導(dǎo)的凋亡.pdf

1、第一部分、ROS調(diào)節(jié)大鼠血管中膜干細胞向血管平滑肌細胞分化機制的研究
　　研究背景:
　　心血管疾病已經(jīng)成為危脅人類健康的首位疾病。血管疾病常為始發(fā)原因，而且缺乏有效的治療手段。血管平滑肌細胞的生長異常對血管病的形成，發(fā)展和疾病預(yù)后起重要作用。目前關(guān)于血管平滑肌細胞生物學(xué)的研究主要集中在正常血管中成熟的收縮型血管平滑肌細胞，然而，血管受到損傷后，另一類型的血管平滑肌細胞，即合成型平滑肌細胞越來越受關(guān)注。與收縮型平滑肌細胞相比

2、，合成型平滑肌細胞的特點表現(xiàn)為生長快，分泌多種細胞因子或生長因子從而引起血管損傷。然而，關(guān)于合成型平滑肌細胞的來源至今尚未闡明。
　　目前，公認的觀點是，血管損傷后，合成型平滑肌細胞來源于位于血管中膜的成熟的收縮型平滑肌細胞去分化或表型修飾。另有觀點認為合成型平滑肌細胞來自骨髓來源干細胞和血管局部存在的自身干細胞。顯然，骨髓來源干細胞對血管損傷的影響主要局限在早期的炎癥反應(yīng)階段，其分化為合成型平滑肌細胞的概率極低。因而，合成型平滑

3、肌細胞更有可能來源于局部血管壁。也就是說，合成型平滑肌細胞可能來源于收縮型平滑肌細胞去分化或者局部存在的血管自身干細胞，然而，兩者的貢獻大小尚無文獻報道。有趣的是，近期一篇報道引起了廣泛關(guān)注:血管中膜存在一群(＜10％) SM-MHC(-)干細胞，稱為中膜多能血管干細胞(MVSCs)，該細胞通過激活并分化為合成型平滑肌細胞，而不是成熟平滑肌細胞去分化，引起血管病變。盡管未采用條件性平滑肌細胞譜系示蹤技術(shù)(lineage tracing)

4、來追蹤血管平滑肌細胞的最終命運，但是，該研究再次強調(diào)了系統(tǒng)研究平滑肌細胞來源的重要性和細胞體內(nèi)譜系示蹤研究對血管病理研究的重要意義。
　　研究目的:
　　研究大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞來自中膜多能血管干細胞的分化，闡明中膜多能血管干細胞向合成型平滑肌細胞分化的分子機制。
　　研究方法:
　　1.大鼠中膜多能血管干細胞(MVSCs)培養(yǎng):采用酶消化法分離和原代培養(yǎng)大鼠中膜多能血管干細胞，分別采用干細胞培養(yǎng)體系和普通

5、培養(yǎng)體系進行培養(yǎng)，傳代。
　　2.細胞分化實驗:采用PDGF-BB誘導(dǎo)，使維持于干細胞培養(yǎng)基中的大鼠中膜多能血管干細胞向平滑肌細胞分化;分別采用相應(yīng)的誘導(dǎo)因子使大鼠中膜多能血管干細胞向骨，軟骨和脂肪分化。
　　3.基因干擾:采用RNAi方法，抑制細胞內(nèi)Pla2g7或NEDD8基因表達。
　　4.Real-time RT-PCR:不同條件下獲得的細胞使用TRIzol法提取總RNA，采用Real-time RT-PCR檢測

6、相應(yīng)基因mRNA表達水平的變化。
　　5.Western blot實驗:采用蛋白裂解液裂解不同條件下獲得的細胞，BCA試劑盒測定蛋白濃度。獲得的蛋白裂解產(chǎn)物用SDS-PAGE膠進行凝膠電泳后檢測相應(yīng)目的蛋白的表達水平。
　　6.免疫熒光染色:細胞接種于預(yù)先鋪細胞爬片的六孔板內(nèi)培養(yǎng)，行相應(yīng)刺激后，固定、封閉后先后加入相應(yīng)一抗和熒光二抗孵育，采用激光共聚焦顯微鏡或普通熒光顯微鏡觀測相應(yīng)蛋白在細胞內(nèi)的表達情況。
　　7.流式

7、細胞術(shù):采用流式細胞術(shù)檢測細胞表面或細胞內(nèi)相應(yīng)蛋白的表達。
　　8.[3H]胸腺嘧啶摻入法:[3H]胸腺嘧啶摻入法檢測細胞的增殖能力。
　　9.活性氧(ROS)測定:細胞內(nèi)ROS水平采用DCHF探針結(jié)合后，共聚焦顯微鏡檢測ROS生成，圖像采用IPP軟件計算。
　　10.統(tǒng)計學(xué)分析:所有實驗重復(fù)至少3次，結(jié)果采用單因素方差分析或Holm'st檢驗。P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.

8、從大鼠胸主動脈新分離培養(yǎng)的中膜多能血管干細胞(MVSCs)表達干細胞相關(guān)標志，在傳統(tǒng)的培養(yǎng)體系(RGM)而不是在干細胞培養(yǎng)體系(SCGM)中能快速分化為合成型血管平滑肌細胞:
　　(1)與培養(yǎng)條件無關(guān)，僅有少量新分離的細胞可貼壁存活并生長。與成熟的收縮型平滑肌細胞相比，該細胞的平滑肌細胞相關(guān)標志，包括αSMA， SM22α，h1-calponin和smoothelin表達水平極低。
　　(2) RGM培養(yǎng)的細胞經(jīng)歷向合成型血

9、管平滑肌細胞的分化，即αSMA，SM22α，h1-calponin和smoothelin表達水平逐漸增高。
　　(3) SCGM培養(yǎng)的細胞，其干細胞標志(NFM，Sox10和S100β)的mRNA水平在培養(yǎng)的早期先上調(diào)后下降，最終回到基礎(chǔ)水平;而RGM培養(yǎng)的細胞，其干細胞標志的mRNA水平與新分離的細胞相比，未發(fā)生改變。
　　(4)免疫熒光染色的結(jié)果顯示，幾乎所有SCGM培養(yǎng)的P1代細胞均表達干細胞標志NFM，Sox10和S

10、100β。Western blot和流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，SCGM和RGM培養(yǎng)的A1代和P1代細胞均高表達干細胞標志NFM，Sox10和S100β，其表達水平在SCGM和RGM培養(yǎng)中逐漸下降，但在RGM培養(yǎng)時下降水平更為顯著。
　　(5)新分離的細胞表達間充質(zhì)干細胞的相關(guān)標志CD29，CD90和CD44H，其表達水平在RGM培養(yǎng)至第10代未見下降。
　　2.SCGM培養(yǎng)的MVSCs細胞具有多能性:
　　(1) PDGF-

11、BB顯著上調(diào)了SCGM培養(yǎng)的P2代MVSCs的αSMA，SM22α，calponin和smoothelin的表達。
　　(2)與培養(yǎng)于SCGM的對照組相比，培養(yǎng)于PDGF-BB的細胞，其基質(zhì)合成相關(guān)基因如collagenⅠ，collagenⅢ， elastin以及MMP2/9的表達上調(diào)。
　　(3)與培養(yǎng)于SCGM的對照組相比，培養(yǎng)于RGM和PDGF-BB的細胞增殖能力更強，與其平滑肌細胞相關(guān)標志的表達正相關(guān)。
　　(

12、4) SCGM培養(yǎng)的P3代MVSCs，分別在相應(yīng)細胞因子的誘導(dǎo)下，可分化為脂肪細胞，骨或軟骨細胞。
　　3.內(nèi)源性活性氧(ROS)在MVSCs向合成型血管平滑肌細胞分化過程中發(fā)揮負調(diào)控作用:
　　(1)與分化的大鼠中動脈平滑肌細胞（RASMCs）相比，MVSCs表達高水平的內(nèi)源性ROS，在分化為RASMCs過程中，內(nèi)源性ROS表達逐漸下降。
　　(2)在PDGF誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞(VSMCs)中，抗氧化基因Nrf2，

13、NQO1，GCLC，GR以及SOD2表達顯著上調(diào)。以上基因在RGM培養(yǎng)的MVSCs中，其表達水平自P3代開始顯著上調(diào)并維持到P10代細胞。
　　(3)在SCGM培養(yǎng)的P2代MVSCs，加入ROS清除劑Tiron和NAC后，細胞內(nèi)αSMA，SM22α，calponin和smoothelin表達顯著上調(diào)。而且，與未加入ROS清除劑的MVSCs相比，誘導(dǎo)的VSMCs增殖能力更強。
　　4.脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Phospholip

14、ase A2，group7，Pla2g7)通過生成ROS在MVSCs向合成型血管平滑肌細胞分化過程中發(fā)揮負調(diào)控作用:
　　(1)在PDGF誘導(dǎo)的MVSCs向VSMCs分化過程中，Pla2g7的mRNA表達下降。
　　(2)抑制Pla2g7基因表達增強了MVSCs向VSMCs分化。
　　結(jié)論:
　　1.新分離的存活的大鼠胸主動脈中膜的細胞是一類中膜多能血管干細胞(MVSCs)，該細胞具有多能性，能快速分化為合成型血

15、管平滑肌細胞。
　　2.內(nèi)源性活性氧(ROS)對維持MVSCs的未分化狀態(tài)起關(guān)鍵作用，抑制內(nèi)源性ROS生成啟動了MVSC向合成型VSMCs的分化。
　　3.Pla2g7通過促進內(nèi)源性ROS生成，在維持MVSCs的未分化狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分、Irisin通過ERK信號通路促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖并部分抑制高糖誘導(dǎo)的凋亡
　　研究背景:
　　目前研究證實，在威脅人類健康的多種慢性代謝性疾病，如代

16、謝綜合征，Ⅱ型糖尿病等，往往伴隨內(nèi)皮細胞的損傷和功能障礙。血管內(nèi)膜的完整性是血管發(fā)揮功能的保障和前提條件，而在許多慢性代謝性疾病中，內(nèi)皮細胞增殖與凋亡對維持血管內(nèi)膜的完整性發(fā)揮關(guān)鍵作用?；诖?，通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的增殖和凋亡修復(fù)損傷后的內(nèi)皮細胞，從而修復(fù)損傷的血管內(nèi)膜，使其恢復(fù)完整性對許多代謝性疾病引起的血管病的轉(zhuǎn)歸具有重要意義。因此，尋找通過促進內(nèi)皮細胞增殖，減少凋亡的理想靶點對代謝性血管病的治療是目前研究的熱點，但目前的進展仍不理想。

17、
　　眾所周知，鍛煉對代謝性疾病和心血管疾病的預(yù)防和治療具有十分積極的作用。研究證明，Irisin是一種新發(fā)現(xiàn)的肌因子，是連接鍛煉和代謝平衡的橋梁。當機體鍛煉時，Irisin從骨骼肌中的釋放出來，可廣泛參與機體適度減肥，改善葡萄糖耐受不良等癥狀。最近的研究發(fā)現(xiàn)，血液中Irisin水平在Ⅱ型糖尿病患者及慢性腎病患者中均降低。另有研究證實，Irisin可作為肌肉來源的調(diào)節(jié)能量消耗的信號，通過促進棕色脂肪產(chǎn)熱從而在機體不同組織發(fā)揮功能。

18、研究還發(fā)現(xiàn)，持續(xù)鍛煉可促進Irisin表達，從而使BDNF基因表達顯著上升。另外，Irisin還可通過調(diào)節(jié)骨細胞分化在骨代謝中發(fā)揮作用。有趣的是，一項新的證據(jù)表明，Irisin可通過激活STAT3信號通路促進小鼠H19-7 HN細胞增殖。該研究提示，除了能調(diào)節(jié)機體代謝平衡，Irisin還具有促增殖的作用。然而，Irisin對人內(nèi)皮細胞的作用尚未見任何報道。
　　研究目的:
　　研究Irisin對人內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響，并

19、闡明Irisin影響人內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的分子機制。
　　研究方法:
　　1.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)進行實驗研究。
　　2.人重組Irisin蛋白表達與純化進行實驗研究。
　　3.[3H]胸腺嘧啶摻入實驗檢測Irisin對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖的影響。
　　4.細胞計數(shù)法檢測Irisin對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖的影響。
　　5.免疫熒光染色檢測Irisin處理后人臍靜脈內(nèi)皮細胞Ki67的表達。

20、
　　6.Western blot檢測Irisin處理后人臍靜脈內(nèi)皮細胞信號通路蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達。
　　7.流式細胞術(shù)檢測Irisin處理后人臍靜脈內(nèi)皮細胞的凋亡。
　　8.統(tǒng)計學(xué)分析:所有實驗重復(fù)至少3次，結(jié)果采用單因素方差分析或Holm's t檢驗。P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.Irisin促進HUVEC的增殖:
　　(1)[3H]胸腺嘧啶摻入實驗結(jié)果顯示，

21、與對照組相比，無血清條件下20 nM的irisin使HUVEC的[3H]胸腺嘧啶摻入率增加了約2.4倍。
　　(2)細胞計數(shù)法的結(jié)果顯示，20nM和40nM的irisin促進了HUVEC的增殖。
　　(3) Ki67免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組相比，20nM irisin顯著增加了表達Ki67細胞的數(shù)量。
　　2.Irisin通過激活ERK信號通路促進HUVEC增殖:
　　(1) Western blot結(jié)果顯

22、示，Irisin處理后，HUVEC的磷酸化ERK的蛋白水平升高，而磷酸化p38 MAPK和AKT的蛋白水平未受影響。
　　(2) ERK抑制劑U0126抑制Irisin誘導(dǎo)的ERK磷酸化后，Ki67免疫熒光染色和[3H]胸腺嘧啶摻入實驗結(jié)果顯示，ERK抑制劑抑制了對irisin誘導(dǎo)的HUVEC的增殖。
　　3.Irisin減少了高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡:
　　流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，20nM Irisin有效減少了高糖誘導(dǎo)

23、的HUVEC凋亡。
　　4.Irisin下調(diào)了Bax，Caspase-9和Caspase-3的表達，上調(diào)了抗凋亡蛋白Bel-2表達:
　　Western blot結(jié)果顯示，20nM irisin處理后，Bax，Caspase-9和Caspase-3的表達下降，抗凋亡蛋白Bcl-2表達升高，GSK-3β與Bad表達未受影響。
　　結(jié)論:
　　1.Irisin促進HUVEC增殖。
　　2.Irisin通過激活E