RNA干擾靶向抑制表皮生長(zhǎng)因子受體對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖和化療敏感性影響的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建針對(duì)EGFR的短發(fā)卡狀RNA質(zhì)粒表達(dá)載體，觀察能否有效抑制大腸癌LoVo細(xì)胞株表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的表達(dá)以及對(duì)細(xì)胞增殖的影響。確定有效的序列后，觀察雙位點(diǎn)的RNA干擾技術(shù)較單位點(diǎn)RNA干擾技術(shù)在抑制大腸癌LoVo細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及增強(qiáng)5-氟尿嘧啶(5-FU)化療敏感性等方面是否有更明顯的效果。 方法：體外合成EGFR短發(fā)卡狀雙鏈RNA和Pgenesil-1質(zhì)粒構(gòu)建兩個(gè)表達(dá)載

2、體pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2，脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人大腸癌LoVo細(xì)胞后24，48，72，96，144小時(shí)RT-PCR和Western-blot檢測(cè)EGFRmRNA和蛋白的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；確定兩個(gè)質(zhì)粒載體都能夠進(jìn)行有效干擾后，再以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人大腸癌LoVo細(xì)胞，G418篩選4周，分5組：1組：LoVo細(xì)胞；2組：對(duì)照質(zhì)粒載體HK；3組：pU6-EGFR-shRNA

3、-1；4組：pU6-EGFR-shRNA-2；5組：pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2各半量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western-blot檢測(cè)mRNA和蛋白的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞增殖分析試劑CCK-8(CellCountingKit-8)測(cè)定5-FU不同濃度和時(shí)間對(duì)LoVo細(xì)胞的抑制率和IC50。 結(jié)果：正確地構(gòu)建了兩個(gè)shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體，細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功；轉(zhuǎn)染shRNA后LoVo

4、細(xì)胞的mRNA和蛋白表達(dá)降低，G0-G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少，細(xì)胞凋亡率增加，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延遲，以48-72小時(shí)效果最顯著，但隨著時(shí)間的推移其干擾作用降低。進(jìn)行G418穩(wěn)定篩選后，PCR檢測(cè)3組4組5組mRNA表達(dá)分別下降了(80.2±3.4)％、(81.3±2.8)％和(90.6±2.8)％，Western-blot檢測(cè)蛋白表達(dá)分別下降了(74.1±4.0)％、(73.4±2.3)％和(90.4±3.3)％，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

5、增加了(10.4±0.5)％、(10.1±0.4)％和(14.2±0.5)％，同時(shí)對(duì)5-FU的IC50和細(xì)胞抑制率作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：5組，3組4組和1組2組三者之間比較有顯著性差異，而1組2組間、3組4組間各項(xiàng)比較差異無(wú)顯著性。 結(jié)論：構(gòu)建的質(zhì)粒載體可以成功的進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)，兩條EGFR-shRNA均可有效抑制大腸癌LoVo細(xì)胞EGFR表達(dá)，阻滯更多的細(xì)胞位于G0-G1期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡而抑制細(xì)胞增殖，并且能提高5-FU對(duì)癌細(xì)胞的殺