消減SELEX技術(shù)的建立.pdf

1、惡性腫瘤是目前人類死亡的主要原因之一。人類對腫瘤的早期診斷和有效治療缺乏特異性是惡性腫瘤對人類生存產(chǎn)生巨大威脅的主要原因。目前所發(fā)現(xiàn)并用于早期臨床診斷的腫瘤標志物與正常細胞相比還沒有質(zhì)的區(qū)別，只是量的不同，缺乏真正的特異性；手術(shù)切除、放療和化療的聯(lián)合應(yīng)用是目前臨床上治療腫瘤的主要手段，雖然手術(shù)切除是去除實體瘤組織的有效方法，但在切除腫瘤組織的同時把一部分正常組織也擴大切除了，對人體創(chuàng)傷大，并且還有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的危險，術(shù)后仍需放療和化療，但

2、是，不論是放射性同位素還是化療藥物對于腫瘤細胞和正常細胞都不加區(qū)分的一起殺死，因此在治療腫瘤的同時也對人體造成了極大的損害，并且由于不能使用較大劑量而嚴重影響放療和化療的效果。當(dāng)前惡性腫瘤早期診斷和有效治療方面存在的諸多不利因素的一個根本原因是人們對正常細胞和惡性腫瘤細胞之間差異的理解缺乏足夠的知識。 SELEX(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)技術(shù)是20世

3、紀90年代發(fā)展起來的一種生物文庫技術(shù)，該技術(shù)的目的就是利用人工合成的隨機寡核苷酸文庫篩選某一靶分子的特異寡核苷酸配基。由于SELEX技術(shù)具有可篩選的靶分子范圍非常廣，理論上能篩選已知的所有分子；篩選得到的配基親合力和特異性極強，遠高于其他任何類型的配基；操作簡便，篩選周期短等優(yōu)點，SELEX技術(shù)在臨床診斷和疾病治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。 本研究將消減雜交的原理引入SELEX篩選，分別以分化前后PC12細胞為消減靶子和篩選靶子，

4、建立消減SELEX技術(shù)，并篩選獲得特異識別已分化PC12細胞而不識別未分化PC12細胞的單鏈DNA(singlestrandedDNA，ssDNA)配基。期望能夠為臨床腫瘤診斷和治療提供新的、實用的技術(shù)方法。 為了建立以完整細胞為靶子的消減SELEX技術(shù)，我們首先建立以單一蛋白為靶子，用隨機ssDNA文庫進行SELEX篩選的方法，為建立以完整細胞為靶子的消減SELEX技術(shù)提供技術(shù)準備。研究結(jié)果表明：同樣大小的ssDNA和雙鏈DN

5、A(double-strandedDNA，dsDNA)在7M尿素12％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegeleletrophoresis，PAGE)中的電泳行為不同，ssDNA由于形成較為復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，泳動速度比dsDNA慢。我們利用這一特點，以不對稱PCR(polymerasechainreaction，PCR)方法首先擴增制備了ssDNA文庫。通過對人工合成隨機ssDNA文庫進行DNA序列測定證實，實驗所用的隨

6、機ssDNA文庫的隨機度是好的，能夠保證SELEX篩選所需要的庫容量。在此基礎(chǔ)上，我們以商品化的、包被在磁珠表面的鏈霉親合素為靶子，用隨機ssDNA文庫篩選特異識別鏈霉親合素的ssDNA配基，經(jīng)過12輪篩選，流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)特異配基已被富集。配基DNA序列測定后，核苷酸序列二級結(jié)構(gòu)分析得到共有的單莖環(huán)結(jié)構(gòu)。生物素與磁珠作用后，封閉了配基與包被在磁珠表面的鏈霉親合素的結(jié)合位點，第12輪篩選ssDNA文庫不再與磁珠結(jié)合，并且配基競爭抑制生

7、物素與鏈霉親合素的結(jié)合，證實富集的文庫是特異識別鏈霉親合素的ssDNA配基。以上檢測所用配基是異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanat，F(xiàn)ITC)標記配基，可用流式細胞儀檢測結(jié)合在磁珠表面的FITC標記配基的量，結(jié)合在磁珠表面的FITC標記配基的量越大，熒光強度值越大，圖形右移越明顯。以上，我們通過對包被在磁珠表面的鏈霉親合素用隨機ssDNA文庫進行的SELEX篩選，建立了ssDNA文庫SELEX方法。

8、用固定化的單一蛋白為靶子進行SELEX篩選，操作相對簡便。在已建立的ssDNA文庫SELEX方法基礎(chǔ)上，我們以已分化和未分化PC12細胞為模型建立了以完整細胞為靶子的消減SELEX技術(shù)。首先培養(yǎng)PC12細胞并用神經(jīng)生長因子(nervegrowthfactor,NGF)誘導(dǎo)分化，獲取已分化和未分化PC12細胞，分別作為消減靶子和篩選靶子；然后先將未分化PC12細胞與隨機ssDNA文庫共同孵育，以去除識別未分化PC12細胞與已分化PC12細

9、胞共有成分的ssDNA配基，對文庫進行消減，再將消減文庫與已分化PC12細胞共同孵育，對文庫進行篩選，洗去不與已分化PC12細胞結(jié)合的ssDNA文庫，PCR擴增與已分化PC12細胞結(jié)合的ssDNA文庫，不對稱PCR擴增并切膠純化制備ssDNA文庫用于下一輪篩選。經(jīng)過6輪消減SELEX篩選，放射性同位素和流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)：隨著篩選輪次的增加，ssDNA文庫逐漸富集，富集的ssDNA配基特異識別完整已分化PC12細胞，而不識別未分化PC1

10、2細胞；測定并分析富集的配基DNA序列發(fā)現(xiàn)這些配基可能為G-四聚體結(jié)構(gòu)。用流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)：23個單一序列配基均與已分化PC12細胞具有較強的結(jié)合，而與未分化PC12細胞不結(jié)合，其中配基17與已分化PC12細胞的結(jié)合最強。用配基17對兩種細胞等比例混合物進行流式細胞術(shù)檢測，出現(xiàn)了兩個峰，一個峰是與未分化PC12細胞結(jié)合的峰，另一個峰是與已分化PC12細胞結(jié)合的峰，說明篩選得到的單一序列配基能夠特異識別混合物中已分化PC12細胞。

11、 為了進一步研究經(jīng)過消減SELEX篩選得到的高親合力配基的結(jié)構(gòu)與功能，我們對用消減SELEX技術(shù)篩選到的、與已分化PC12細胞結(jié)合最強的配基17進行了改造，將配基17兩端的固定序列部分或全部截去，保留中間的隨機序列，使得配基的長度分別減小到25bp(AP17-25)、38bp(AP17-38)和48bp(AP17-48)，流式細胞術(shù)和熒光顯微鏡檢測證實，改造后的AP17-25、AP17-38和AP17-48仍能特異識別完整已分化PC1

12、2細胞，而不識別未分化PC12細胞；AP17-38也能夠從兩種細胞混合物中特異識別出已分化PC12細胞。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：AP17-38結(jié)合在已分化PC12細胞的胞漿內(nèi)。 總之，我們以包被在磁珠表面的鏈霉親合素為靶子，建立了ssDNA文庫SELEX方法，并檢測了實驗所用隨機ssDNA文庫的隨機度、建立了ssDNA文庫的制備方法，同時證實了使用FITC標記配基以流式細胞儀檢測珠狀物(包括磁珠和細胞)是可行的；以未分化PC1

13、2細胞作為消減靶子，已分化PC12細胞作為篩選靶子，從隨機ssDNA文庫中篩選得到特異識別完整已分化PC12細胞，而不識別未分化PC12細胞的ssDNA配基，建立了以完整細胞為靶子的消減SELEX技術(shù)；對篩選到的配基進行改造后，仍能特異識別完整已分化PC12細胞，而不識別未分化PC12細胞，改造后的配基結(jié)合在已分化PC12細胞的胞漿內(nèi)。 消減SELEX技術(shù)的建立為我們快速篩選識別兩種同源差異細胞的標志物提供了實用的技術(shù)方法，也將