小鼠胚胎干細(xì)胞SM22α-EGFP表達(dá)克隆的建立及血管平滑肌細(xì)胞體外發(fā)育的動(dòng)態(tài)觀察.pdf

1、研究背景及目的:動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄及高血壓等心血管疾病的重要特點(diǎn)之一是血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的異常生長(zhǎng)及增殖。成熟動(dòng)物體內(nèi)的VSMCs可表達(dá)一系列收縮蛋白、離子通道及信號(hào)分子，這些蛋白對(duì)于VSMCs的首要功能——收縮是必需的。然而，在各種損傷性刺激的作用下，VSMCs可以去分化，由靜止的收縮表型向增殖能力明顯加強(qiáng)的合成表型轉(zhuǎn)換。了解VSMCs發(fā)育及分化的過(guò)程不僅有助于闡明如何在心血管病中阻斷這一異常轉(zhuǎn)換，而且對(duì)了解先天性血管發(fā)育

2、缺陷及腫瘤的血管發(fā)育至關(guān)重要。然而，目前對(duì)于VSMCs特異分化及終末分化誘因的研究非常有限，原因之一是缺乏一種合適的VSMCs發(fā)育模型。由于在體內(nèi)無(wú)法獲得發(fā)育早期的VSMCs，胚胎干細(xì)胞(ESCs)為早期VSMCs的譜系形成、分化及成熟機(jī)制的研究提供了一種有價(jià)值的體外模型。ESCs的特點(diǎn)是可以在培養(yǎng)期間長(zhǎng)期保持未分化狀態(tài)，同時(shí)保留分化成任何一種三胚層來(lái)源細(xì)胞的能力。在體外，ESCs可以自發(fā)地分化成胚胎小體(EBs)。EBs可以生成高度分

3、化的細(xì)胞，包括VSMCs，并可以模擬早期胚胎發(fā)育時(shí)的許多過(guò)程。因此，本研究的目的是對(duì)ESCs來(lái)源的VSMCs進(jìn)行標(biāo)記并對(duì)其進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。我們建立了在VSMCs特異性蛋白SM22α啟動(dòng)子控制下穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的ESCs株，證明這些轉(zhuǎn)基因的ESCs在發(fā)育早期可以表達(dá)VSMCs特異性的EGFP，并使一群EGFP陽(yáng)性、具有VSMCs形態(tài)及免疫細(xì)胞化學(xué)特性的細(xì)胞亞系得到了確認(rèn)。 材料與方法: 1.細(xì)胞培養(yǎng)小鼠

4、ESC細(xì)胞株R1(ATCC)培養(yǎng)于絲裂霉素(10μg/mL，2h)處理后的滋養(yǎng)層細(xì)胞STO(小鼠成纖維細(xì)胞株)上。ESCs在生長(zhǎng)到亞融合狀態(tài)時(shí)行傳代，每天換液以維持其未分化狀態(tài)。 2.載體構(gòu)建541bp的VSMCs特異性SM22α啟動(dòng)子序列經(jīng)PCR法獲得。將該片段插入到T載體中構(gòu)成PTSM載體，再經(jīng)SAC-1及APA-1雙酶切后亞克隆至無(wú)啟動(dòng)子的EGFP報(bào)告載體(PEGFP-1)中構(gòu)成PSM-EGFP載體。 3.ESCs

5、轉(zhuǎn)染用電穿孔法將線性化的PSMEGFP載體轉(zhuǎn)染到ESCR1細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的ESCs(SM22α-EGFP)在含G418的選擇性培養(yǎng)液中培養(yǎng)和篩選。將擴(kuò)增后10d的轉(zhuǎn)基因ESCs于解剖顯微鏡下用Pasteur槍頭挑取1.5mm～2mm的細(xì)胞克隆行擴(kuò)增培養(yǎng)。 4.基因組PCR鑒定應(yīng)用TaqPCR試劑盒行基因組DNAPCR分析。所擴(kuò)增片段為PEGFP-1載體中EGFP的cDNA序列。 5.ESCs分化及EBs模型的建立ESCs

6、細(xì)胞培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)，用0.25％胰酶及0.53mmol/LEDTA消化后，鋪于明膠包被的培養(yǎng)皿中，3h后大部分STO細(xì)胞已貼壁。將未貼壁的ESCs稀釋后接種于細(xì)菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液除無(wú)LIF外與ESCs培養(yǎng)液相同。懸浮培養(yǎng)后6d，將EBs接種于0.1％明膠鋪被的培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)，每天換液。 6.免疫細(xì)胞化學(xué)染色固定的EBs經(jīng)0.05mol/LTBS中洗滌后，在含0.25％TritonX-100和0.5mol/LNH4Cl的TBS

7、中通透20min。5％牛血清白蛋白室溫封閉1h后，與一抗在4℃孵育過(guò)夜。抗小鼠抗體包括SMα-actin、Flk-1、Caspase-3及SMMHC。二抗為四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)或FITC標(biāo)記抗體。 7.RT-PCR參照說(shuō)明書(shū)用Trizol提取不同時(shí)間點(diǎn)EBs中的RNA。取1μgRNA進(jìn)行以下物質(zhì)的半定量PCR：Pecam-1(CD31)、SM22α、myocardin、EGFP及GAPDH。 8.慢速顯微攝

8、像技術(shù)(time-lapse)將EBs接種于35mm培養(yǎng)皿中，置5％CO2，37℃恒溫小室，在配有自動(dòng)攝像裝置(CoolSNAPfx)的倒置相差顯微鏡(OlympusⅨ-70)下觀察細(xì)胞移行，每隔10min作序列攝影，連續(xù)拍攝39張，共6.5h。遷移速率采用圖像分析軟件(Image-ProPlus5.1)示蹤程序?qū)鄯e移行距離及速率實(shí)施分析測(cè)定。 結(jié)果: 1.SM22α-EGFP表達(dá)載體構(gòu)建及陽(yáng)性ESCs克隆篩選以小鼠S

9、TO細(xì)胞DNA為模板擴(kuò)增得到541bp特異性目的基因片段，與預(yù)期片段大小一致。為驗(yàn)證插入序列，分別對(duì)PTSM和PSME-GFP兩種質(zhì)粒行ECORⅠ和SMAⅠ酶切鑒定，酶解產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析證實(shí)片斷大小與理論計(jì)算相符合。用電穿孔法將線性載體轉(zhuǎn)染至ESCs，隨后對(duì)轉(zhuǎn)染ESCs實(shí)施篩選，轉(zhuǎn)染后第6d可見(jiàn)G418耐藥性克隆。共擴(kuò)增24株ESCs細(xì)胞克隆，有4株經(jīng)基因組PCR證實(shí)為陽(yáng)性。以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果均來(lái)自1號(hào)克隆，為4株陽(yáng)性克隆之一

10、。 2.EBs模型的建立及形態(tài)特征R1細(xì)胞在STO細(xì)胞上呈團(tuán)生長(zhǎng)，細(xì)胞致密，邊界不清。EBs從第3d開(kāi)始形成，此后體積逐漸增大。在第6d可見(jiàn)EBs中心部分透光性逐漸減弱，呈黑色壞死區(qū)，Caspase-3免疫熒光染色可見(jiàn)EBs中心存在大量凋亡細(xì)胞。第6dEBs貼壁后可向四周分化延伸出各種形態(tài)細(xì)胞，免疫熒光染色證實(shí)有VSMCs形成。 3.ESCs細(xì)胞分化過(guò)程中VSMCs特異性EGFP的表達(dá)時(shí)相為分析VSMCs分化表達(dá)SM22

11、α-EGFP的時(shí)間變化特征，觀察不同時(shí)間點(diǎn)EBs分化細(xì)胞中EGFP的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)EBs在第6+5d(懸浮培養(yǎng)6d后貼壁培養(yǎng)5d)細(xì)胞表達(dá)熒光，EGFP陽(yáng)性細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多，在第6+24d達(dá)到高峰。EGFP表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿內(nèi)。SM22α啟動(dòng)子可在體內(nèi)VSMCs中特異性地被啟動(dòng)。與肌動(dòng)蛋白異構(gòu)體不同的是，SM22α只在VSMCs中表達(dá)。此外，與鈣調(diào)蛋白、肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白(metavinculin)及肌球蛋白重鏈不同之處在于SM2

12、2α無(wú)剪接變異體。SM22α的啟動(dòng)子序列較短，更易克隆。已有研究顯示，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游441bp的SM22α啟動(dòng)子足以啟動(dòng)基因的表達(dá)，這一點(diǎn)在本實(shí)驗(yàn)中得到了進(jìn)一步證實(shí)。 4.EBs中分子標(biāo)志物的表達(dá)為了進(jìn)一步驗(yàn)證EGFP陽(yáng)性細(xì)胞系VSMCs，選取第6+17dEGFP陽(yáng)性的EBs。免疫熒光染色證實(shí)EGFP陽(yáng)性細(xì)胞SMα-actin及SMMHC染色均為陽(yáng)性，表明SM22α-EGFP轉(zhuǎn)染ESCs細(xì)胞中報(bào)告基因表達(dá)具有VSMCs特異性。

13、對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)ESCs分化形成的EBs實(shí)施RT-PCR分析，隨時(shí)間的延長(zhǎng)EGFP及VSMCs特異性標(biāo)志物表達(dá)水平逐漸增加，同時(shí)觀察到內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)特異性標(biāo)志蛋白PECAM-1具有相同的表達(dá)時(shí)相，提示在EBs分化過(guò)程中有ECs形成。在野生型ESCs分化形成的EBs中亦觀察到VSMCs分化伴有ECs生成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在EBs模型中SM22α啟動(dòng)子能啟動(dòng)VSMCs特異性EGFP表達(dá)，進(jìn)一步用免疫熒光染色及RT-PCR證實(shí)EGFP陽(yáng)性細(xì)胞

14、可以表達(dá)其它VSMCs特異性標(biāo)志物，從而證實(shí)這些細(xì)胞為VSMCs，而不是心肌或骨骼肌細(xì)胞。先前的在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致：SM22α啟動(dòng)子只啟動(dòng)心血管系統(tǒng)SMCs報(bào)告基因的表達(dá)，而內(nèi)臟系統(tǒng)SMCs無(wú)報(bào)告基因表達(dá)，提示SM22α控制下的報(bào)告基因具有心血管系統(tǒng)特異性。 5.VSMCs異質(zhì)性采用本模型可以觀察到VSMCs形態(tài)呈多樣性。大致可分為兩類(lèi)：①紡錘形，散在分布于EBs的延伸細(xì)胞中；②上皮樣多角形細(xì)胞，成群出現(xiàn)，主要位于細(xì)胞密

15、度最大的EBs中心部位。此外，兩種細(xì)胞的遷移速率不同，前者移行伴有明顯的細(xì)胞收縮變形，后者相對(duì)維持原有細(xì)胞形態(tài)。紡錘形細(xì)胞的遷移速率較上皮樣多角形細(xì)胞的速率快。形態(tài)和遷移速率的差異提示可能存在兩種表型VSMCs。獲得整合有SM22α-EGFP序列的ESCs具有以下幾個(gè)意義：首先，證明了SM22α啟動(dòng)子在EBs模型中的調(diào)控表達(dá)具有VSMCs特異性。人SM22α啟動(dòng)子序列可以對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化而來(lái)的VSMCs進(jìn)行分選。其次，該模型可以容易地

16、檢測(cè)到EBs的每一個(gè)細(xì)胞中SM22α啟動(dòng)子的活性，而以前胚胎發(fā)育研究中沿用的報(bào)告基因多數(shù)是lacZ(β-半乳糖苷酶)，其分析過(guò)程較本法繁瑣費(fèi)時(shí)。第三，SM22α-EGFPESC克隆為篩選VSMCs分化所用誘導(dǎo)劑及抑制劑提供了一個(gè)較好的培養(yǎng)體系。最后，重組的ESCs可培育出VSMCs中有EGFP表達(dá)的小鼠，用于針對(duì)VSMCs在各種病理?xiàng)l件下分化調(diào)節(jié)機(jī)制的研究。利用整合有SM22α-EGFP序列的ESCs，結(jié)合相關(guān)細(xì)胞因子協(xié)同的有序誘導(dǎo)，能

17、夠建立一套高效誘導(dǎo)ESCs細(xì)胞分化為VSMCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系。本模型中的兩種不同形態(tài)細(xì)胞是否能代表成體VSMCs的增殖及遷移表型，以及它們之間VSMCs特異性基因表達(dá)譜的差異還需進(jìn)一步研究證實(shí)。 結(jié)論:應(yīng)用PCR等方法成功克隆SM22α-EGFP表達(dá)載體，并應(yīng)用電穿孔方法成功轉(zhuǎn)染ESCsR1細(xì)胞，建立SM22α-EGFP表達(dá)克隆株。ESCs通過(guò)懸浮培養(yǎng)，建立EBs模型。在該模型中觀察到VSMCs和ECs的分化。起源于SM22α-