血管緊張素Ⅱ促進小鼠胚胎干細胞定向分化成為血管平滑肌細胞的機制研究.pdf

1、本課題共分為三個部分
　　 第一部分：小鼠胚胎干細胞定向分化成為血管平滑肌細胞的模型建立
　　 研究目的：深入了解血管平滑肌細胞(VSMCs)發(fā)育及分化的特點對于了解血管疾病的過程非常重要。然而，目前對VSMCs特異分化及終末分化誘因的研究非常有限，原因之一是缺乏一種合適的VSMCs發(fā)育模型。胚胎干細胞為早期VSMCs的譜系形成、分化及成熟機制的研究提供了一種有價值的體外模型，而從胚胎干細胞單一、定向分化成為血管平滑肌細

2、胞為將來的進一步研究其分化機制奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法：將充滿活力的小鼠胚胎干細胞D3系種植于Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)皿/板上，經(jīng)過8天的誘導(dǎo)分化，取其中的2、4、6、8天各個點的細胞進行熒光定量PCR及免疫印跡試驗，驗證其平滑肌標志基因SMA、SM22、calponin、SM-MHC的表達水平。
　　 研究結(jié)果：Ⅳ型膠原成功誘導(dǎo)胚胎干細胞定向分化成為平滑肌細胞，平滑肌標志基因及蛋白可隨誘導(dǎo)時間的增加而同步增加，最高峰在第8

3、天。
　　 結(jié)論：利用Ⅳ型膠原的誘導(dǎo)分化，成功建立起胚胎干細胞單一、定向分化成為血管平滑肌細胞的體外模型，為進一步探討其分化機制奠定基礎(chǔ)。
　　 第二部分：血管緊張素Ⅱ促進小鼠胚胎干細胞定向分化成為血管平滑肌細胞
　　 研究目的：體內(nèi)外實驗均發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ不僅僅是一個體液調(diào)節(jié)因子，它還是一種促血管新生的因子，可以刺激成血管細胞，包括內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞的生長、發(fā)育、分化及凋亡。本實驗旨在探明AngⅡ在胚胎干細胞

4、分化成為血管平滑肌細胞過程中本身所具有的生理作用。
　　 研究方法：采用在Ⅳ型膠原誘導(dǎo)分化過程中最有分化變化的第四天的干細胞，加入不同濃度的AngⅡ刺激(10-6-10-14mol/L)48小時后檢測平滑肌標志基因SMA、SM22、calponin、SM-MHC的基因及蛋白表達水平。同時對AngⅡ10-9mol/L組及對照組進行免疫熒光的染色比較。此外還分析了AngⅡ(10-6-10-10mol/L)的刺激是否與促進細胞增殖相關(guān)

5、的MTT研究。
　　 研究結(jié)果：AngⅡ可以濃度依賴性的刺激上述標志基因的改變，在mRNA水平SMA、SM22、calponin及SM-MHC的刺激最高峰處在10-9mol/L(p<0.01)，而在蛋白水平SMA、SM22及calponin的峰值在10-9mol/L(p<0.01)。同時免疫熒光染色也顯示出增強的標志基因SMA、SM22、calponin的熒光強度，但是SM-MHC的熒光改變不明顯。此外AngⅡ不同濃度刺激下細胞

6、增殖并未發(fā)生明顯改變。
　　 結(jié)論：AngⅡ可以濃度依賴性的刺激平滑肌標志基因的表達，從而可以促進胚胎干細胞分化成為血管平滑肌細胞，此促進分化的過程與促進細胞增殖無關(guān)。
　　 第三部分：血管緊張素Ⅱ促進小鼠胚胎干細胞定向分化成為血管平滑肌細胞的機制探討
　　 研究目地：本部分通過對AngⅡ細胞外信號通路的探索，重點研究其促進分化過程中的主要參與部分，包括血管緊張素Ⅱ的受體及磷脂酰肌醇3激酶PI3K/Akt信號通路

7、，同時探討AngⅡ在轉(zhuǎn)錄因子水平對分化調(diào)控的可能參與因子。
　　 研究方法：Ⅳ型膠原誘導(dǎo)分化第四天的胚胎干細胞中，預(yù)先加入AngⅡⅠ型受體(AT1R)阻斷劑氯沙坦(losartan)、AngⅡⅡ型受體(AT2R)阻斷劑PD123319，及NF-κB抑制劑BAY11-7082，后給予AngⅡ10-9mol/L的刺激，檢測平滑肌標志基因蛋白SMA及calponin的改變。PI3K/Akt信號通路研究上，主要通過AngⅡ不同濃度(10

8、-6-10-10mol/L)刺激下檢測相關(guān)的PI3K下游磷酸化Akt的變化；同時分析PI3K阻斷劑LY294002作用下平滑肌標志基因蛋白SMA和calponin及磷酸化Akt的改變。此外在轉(zhuǎn)錄水平檢測AngⅡ不同濃度(10-6-10-10mol/L)對平滑肌標志基因SMA及SM22啟動子活性的影響，及對相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NF-KappaB(NF-κBp50,p65)，c-Jun等的作用。關(guān)于AngⅡ促進分化是否涉及炎癥相關(guān)基因蛋白的表達的驗

9、證，是通過檢測AngⅡ刺激下(10-6-10-10mol/L)兩個炎癥相關(guān)蛋白TNF-a及c-fos的表達來進行。
　　 研究結(jié)果：AngⅡ(10-9mol/L)的促進平滑肌標志基因SMA和calponin表達的作用可以被AngⅡⅠ型受體阻斷劑losartan所阻斷，而非AngⅡⅡ型受體阻斷劑PD123319。AngⅡ濃度依賴性的促進磷酸化Akt的表達，在AngⅡ10-9mol/L(p<0.01)刺激下達最高峰。PI3K抑制劑L

10、Y294002可以阻斷AngⅡ刺激的平滑肌標志基因的上調(diào)，同時也可以阻斷磷酸化Akt的表達，但是兩組阻斷劑效果不盡相同，AngⅡ刺激組較之對照組仍然有相對高表達的平滑肌標志基因及磷酸化Akt表達水平。此外AngⅡ可以在適當(dāng)濃度(10-8-10-9mol/L)刺激平滑肌標志基因SMA啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，同時可以濃度依賴性的刺激NF-κBp50的表達，最高刺激濃度為10-9mol/L(p<0.01)，而NF-κB抑制劑BAY11-7082則可

11、抑制AngⅡ(10-9mol/L)的促進平滑肌標志基因SMA和calponin表達的作用(p<0.01)。PI3K抑制劑LY294002可以阻斷NF-κBp50的高表達，但是AngⅡ刺激組(10-9mol/L)較之對照組仍顯示出相對高的表達活性。不同濃度的AngⅡ的刺激并未顯著上調(diào)炎癥相關(guān)因子TNF-a及c-fos的表達。
　　 結(jié)論：AngⅡ主要通過AT1受體參與促進胚胎干細胞分化成為血管平滑肌細胞的過程。AngⅡ雖然主要是通