低硒對(duì)F344大鼠子代神經(jīng)行為發(fā)育和海馬神經(jīng)前體細(xì)胞分化、成熟蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、背景與目的:
　　硒是人和動(dòng)物生命活動(dòng)所必需的微量元素。硒缺乏會(huì)引起含硒酶活性降低,氧自由基清除受阻、內(nèi)分泌紊亂等一系列機(jī)體功能障礙,其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響也越來(lái)越引起學(xué)者們的重視。
　　前期本課題組建立了人工膳食低硒、低碘和聯(lián)合低硒低碘喂養(yǎng)的SD大鼠動(dòng)物模型,并歷時(shí)近三年繁衍至仔四代,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),仔三代、四代低硒大鼠已經(jīng)表現(xiàn)出不同程度體格和神經(jīng)發(fā)育延遲、腦內(nèi)EGFR/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路有一定影響、但Morris水迷宮空間記

2、憶能力沒(méi)有明顯影響等。
　　本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上,再次通過(guò)人工低硒飼料喂養(yǎng) F344近交系大鼠復(fù)制低硒動(dòng)物模型,深入細(xì)致研究其子代出生后早期不同時(shí)間點(diǎn)4d,7d,14d,21d的含硒酶 GPx(glutathione peroxidase,谷胱甘肽過(guò)氧化物酶)活性變化、早期神經(jīng)行為發(fā)育、子代發(fā)育期大鼠開(kāi)場(chǎng)行為和Morris水迷宮空間記憶能力表現(xiàn)。并通過(guò)檢測(cè)腦神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)發(fā)育、海馬神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記蛋白(nestin)、增殖細(xì)胞核

3、抗原(PCNA)、膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟蛋白――膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)和2’,3’-環(huán)核甘酸3’-磷酸二酯酶(2,3- cyclic nucleotide,3-phosphodiesterase, CNPase)的表達(dá)情況,從發(fā)育,行為,功能到海馬局部形態(tài)結(jié)構(gòu)和分化、成熟蛋白的表達(dá),進(jìn)一步深入探討低硒對(duì)早期神經(jīng)發(fā)育的影響,尋找這一影響的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)。
　　方法

4、:
　　1.復(fù)制F344低硒大鼠動(dòng)物模型參照本課題組已成功建立的人工膳食SD低硒大鼠模型的飼料配方,以F344純系大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象建立低硒動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)分為兩組,分別喂以不同硒碘水平的人工配制飼料:(1)合成飼料對(duì)照組(Control),硒含量0.1~0.3μg/g,碘含量≥0.2μg/g;(2)低硒組(Se-),硒含量0.02μg/g,碘含量≥0.2μg/g。
　　2. GPx活性測(cè)定改良DTNB法檢測(cè)母代和子一代P4、P7

5、、P14和P21大鼠全血中GPx活性;
　　3.檢測(cè)子一代大鼠出生后生長(zhǎng)體重變化、生理發(fā)育指標(biāo)、早期神經(jīng)行為學(xué)改變和開(kāi)場(chǎng)行為表現(xiàn)。
　　4.Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)觀察子一代大鼠尋找站臺(tái)的潛伏期、搜索策略,穿越原站臺(tái)次數(shù)、在原站臺(tái)象限停留時(shí)間等。
　　5.Nissl(甲苯胺藍(lán))染色觀察子一代大鼠P4、P7、P14和P21海馬形態(tài)學(xué)變化。
　　6.免疫組化技術(shù)觀察生后仔鼠不同時(shí)間點(diǎn)(P4、P7、P14和P

6、21)海馬內(nèi)神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記蛋白nestin、增殖細(xì)胞核抗原PCNA、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟相關(guān)蛋白GFAP、CNPase的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1. GPx活性:(1)母代Se-組大鼠全血GPx活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05);(2)子一代Se-組同日齡大鼠GPx活性也顯著低于相應(yīng)對(duì)照組(P<0.05)。
　　2.早期生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的檢測(cè):Se-組仔鼠出生后早期體重增長(zhǎng)較對(duì)照組緩慢(P<0.05),但耳廓分離、出

7、毛、門齒萌出、睜眼及毛發(fā)發(fā)育等幾個(gè)指標(biāo)與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。
　　3.早期神經(jīng)行為發(fā)育指標(biāo)檢測(cè)中:生后4天時(shí),Se-組仔鼠的平面翻正評(píng)分明顯較對(duì)照組低(P<0.05)、懸崖回避實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性率也顯著低于對(duì)照組;7天時(shí),兩組間無(wú)顯著性差異。P10時(shí),Se-組仔鼠的聽(tīng)覺(jué)驚愕陽(yáng)性達(dá)標(biāo)率低于對(duì)照組(P<0.05);在P12和P14時(shí)的前臂握力和行走能力實(shí)驗(yàn)中,Se-組與對(duì)照組表現(xiàn)無(wú)顯著性差異(P﹥0.05)。開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中,Se-組雄鼠在中央格停

8、留時(shí)間、穿行格數(shù)(活動(dòng)能力)較對(duì)照組明顯減少,(P﹤0.05);Se-組雌鼠在開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)各個(gè)指標(biāo)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。
　　4. Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn):(1)潛伏期:定向航行實(shí)驗(yàn)第4、5天時(shí),Se-組潛伏期明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.01);兩組雌雄性別之間無(wú)顯著性差異;(2)運(yùn)動(dòng)策略結(jié)果:定向航行實(shí)驗(yàn)第5~9時(shí)段采用直線式和趨向式為主要的尋找策略,Se-組在第6和第9時(shí)段的訓(xùn)練中所采取的直線式策略次數(shù)明顯比對(duì)照組少(P=

9、0.009; P=0.03)。(3)空間探索實(shí)驗(yàn)中,Se-組在原站臺(tái)所在象限停留時(shí)間比對(duì)照組短(P<0.05)。
　　5.海馬形態(tài)學(xué)觀察:從P4~P21,海馬各分區(qū)錐體細(xì)胞層逐漸變薄,而齒狀回(DG)顆粒細(xì)胞層細(xì)胞則呈逐漸增多的趨勢(shì)。相同日齡內(nèi),與對(duì)照組相比,Se-組海馬皮層錐體細(xì)胞層較厚,齒狀回(dentate gyrus, DG)內(nèi)臂形成較晚。
　　6.海馬神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記蛋白巢蛋白(nestin)和增殖細(xì)胞核抗原(PC

10、NA)免疫組化結(jié)果:總體上,從P4~P21這個(gè)發(fā)育過(guò)程中,大鼠海馬中都有nestin和PCNA抗原的表達(dá),且兩個(gè)指標(biāo)陽(yáng)性總體表達(dá)趨勢(shì)比較相似,都隨日齡增加逐漸降低。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)和積分光密度值測(cè)量結(jié)果:(1)P4時(shí) Se-組海馬 DG區(qū)的nestin表達(dá)較對(duì)照組多(P<0.05),其余時(shí)間點(diǎn)在相同海馬分區(qū),兩組間陽(yáng)性表達(dá)無(wú)顯著差異。(2)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果:與對(duì)照組相比,Se-組P4~P7海馬CA1和CA3區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多;P21時(shí)C

11、A1和DG區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞也較對(duì)照組多((P<0.05)。
　　7.海馬膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟相關(guān)蛋白免疫組化結(jié)果:(1)GFAP:P4海馬未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá), P7時(shí)低硒組海馬 DG區(qū), P21時(shí)的DG區(qū) GFAP免疫組化積分光密度值較對(duì)照組小(P<0.05),在選取的其余發(fā)育時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著差異(P>0.05)。(2)CNPase:從P4~P7,海馬均未見(jiàn)CNPase陽(yáng)性表達(dá);至P14時(shí),僅能在海馬傘、海馬槽和分子細(xì)胞層見(jiàn)到少量呈絲狀的弱陽(yáng)性表

12、達(dá), P21海馬低硒組和對(duì)照組海馬各區(qū)CNPase的陽(yáng)性表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.成功復(fù)制F344近交系大鼠低硒動(dòng)物模型并繁殖到子一代
　　2.低硒可導(dǎo)致子一代大鼠在早期生長(zhǎng),神經(jīng)生理反射及神經(jīng)行為方面出現(xiàn)不同程度的發(fā)育延遲,影響雄鼠開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中對(duì)新異環(huán)境的適應(yīng)能力。
　　3.低硒可導(dǎo)致子一代大鼠在Morris水迷宮的空間記憶能力減弱。
　　4.低硒能不同程度地延遲大鼠海馬形態(tài)發(fā)