阿托伐他汀對THP-1巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響及機(jī)制探討.pdf

1、研究背景:清道夫受體介導(dǎo)的氧化低密度脂蛋白的蓄積是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中泡沫細(xì)胞形成的關(guān)鍵。CD36屬于B類清道夫受體,豐富表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞膜表面,它是一種主要的oxLDL受體。過氧化物酶體增殖物激活型受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ,PPARγ)是核受體超家族成員之一,作用范圍非常廣,其主要功能是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。PPARγ是一種核轉(zhuǎn)錄因子,具有多種上游調(diào)控作用,既可控制

2、炎癥反應(yīng),亦可誘導(dǎo)CD36基因的表達(dá)。研究提示,oxLDL通過激活PPARγ上調(diào)巨噬細(xì)胞CD36的基因表達(dá)。研究顯示, PPARγ-CD36信號通路在單核巨噬細(xì)胞對氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的攝取、泡沫細(xì)胞形成過程中起到重要作用。PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性受翻譯后機(jī)制磷酸化的調(diào)節(jié),研究表明, PPARγ-Pi是其靶基因的負(fù)向調(diào)節(jié)因子。阿托伐他汀(atorvastatin)除具有顯著的降脂作用外,還具有獨特的心血管疾病預(yù)防作用,如抑制炎癥

3、、穩(wěn)定粥樣斑塊、改善內(nèi)皮功能、抗血小板聚集、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、抑制LDL的氧化修飾、抑制清道夫受體表達(dá)等作用。本研究意在探討阿托伐他汀對THP-1巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響及其影響機(jī)制。
　　目的:觀察阿托伐他汀對THP-1巨噬細(xì)胞膽固醇流入及CD36表達(dá)的影響,阿托伐他汀對ox-LDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積及CD36、PPARγ表達(dá)的影響,阿托伐他汀、PPARγ激動劑與拮抗劑對THP-1巨噬細(xì)胞膽固醇蓄積及CD36、

4、PPARγ表達(dá)及對PPARγ磷酸化水平的影響。
　　方法:在每次實驗前用160 nmol/L佛波酯孵育THP-1細(xì)胞24h,使其誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞,換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后加處理因素。
　　I.用5uM的Atorvastatin與THP-1巨噬細(xì)胞孵育不同時間,即(0h、3h、6h、12h、24h),用不同濃度的Atorvastatin(0μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM)與THP-1巨噬細(xì)胞共同孵育24h

5、,用液體閃爍計數(shù)法檢測細(xì)胞[3H]膽固醇流入情況,采用RT-PCR與Western blotting分別檢測THP-1巨噬細(xì)胞CD36mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　II.用50mg/L oxLDL與不同濃度的Atorvastatin(0μM、0.312μM、1.25μM、5μM)共同孵育24h,空白組作為對照,用液體閃爍計數(shù)法檢測細(xì)胞[3H]膽固醇流入情況,油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況,RT-PCR與Western blott

6、ing分別檢測THP-1巨噬細(xì)胞CD36、PPARγmRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　III.用50mg/L oxLDL分別與PPARγ激動劑ciglitazone(10μM)、PPARγ拮抗劑GW9662(10μM)、atorvastatin(5μM)共同孵育24h,空白組與oxLDL組作為對照,用高效液相色譜分析法檢測細(xì)胞總膽固醇蓄積情況,RT-PCR與Western blotting分別檢測THP-1巨噬細(xì)胞CD36、PPARγ

7、mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)及PPARγ磷酸化的水平。用不同濃度的Atorvastatin(0μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM)與THP-1巨噬細(xì)胞共同孵育24h,Western blotting檢測THP-1巨噬細(xì)胞PPARγ蛋白質(zhì)的表達(dá)及PPARγ磷酸化的水平。
　　結(jié)果:阿托伐他汀使THP-1巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積減少及CD36、PPARγ表達(dá)減少,具體結(jié)果如下:
　　I.阿托伐他汀使THP-1巨噬細(xì)胞膽固醇

8、流入減少及CD36 mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)下調(diào),且成時間與劑量依賴關(guān)系。[3H]膽固醇流入情況:在0μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM時膽固醇流入百分比分別為38.1％、34.6%、31.4%、28.4%、24.5%。
　　II.阿托伐他汀使 THP-1巨噬細(xì)胞膽固醇流入減少,分別為35.9%(control)、47.1%(0μM)、41.2%(0.312μM)、35.1%(1.25μM)、28.3%(5μM)

9、,且能抑制THP-1巨噬細(xì)胞對oxLDL的攝取,油紅O染色可見oxLDL+Atorvastatin組細(xì)胞內(nèi)脂滴較oxLDL組明顯減少,且脂滴顆粒體積變小。阿托伐他汀使 oxLDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞 CD36、PPARγmRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)下調(diào)。
　　III.高效液相色譜分析法檢測細(xì)胞內(nèi)總膽固醇,各處理組細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯與總膽固醇的比值為:41%、60%、72%、52%、55%。阿托伐他汀與PPARγ拮抗劑GW9662使THP

10、-1巨噬細(xì)胞CD36、PPARγ mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)下調(diào)及膽固醇蓄積減少,PPARγ激動劑ciglitazone使THP-1巨噬細(xì)胞CD36、PPARγmRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)上調(diào)及膽固醇蓄積增多。與A組相比,B、C、D、E四組的PPARγ-Pi蛋白質(zhì)的量明顯增加,而四組間差異無顯著性。Atorvastatin使PPARγ蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)而促進(jìn)PPARγ的Pi從而增高PPARγ-Pi/ PPARγ且成量-效關(guān)系。
　　結(jié)論:阿托伐

11、他汀使THP-1巨噬細(xì)胞CD36mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)下調(diào)及膽固醇流入減少,且成時間與劑量依賴關(guān)系。阿托伐他汀引起oxLDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞CD36、PPARγ表達(dá)下調(diào),并使脂質(zhì)蓄積減少。阿托伐他汀通過促進(jìn)PPARγ磷酸化而增高THP-1巨噬細(xì)胞PPARγ-Pi/PPARγ比值,使CD36基因轉(zhuǎn)錄減少,從而使膽固醇蓄積減少。
　　總結(jié):阿托伐他汀可能通過抑制PPARγ依賴的CD36的表達(dá)從而減少THP-1巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積,