槐定堿對(duì)內(nèi)毒素腎損傷小鼠的治療作用及對(duì)LPS識(shí)別受體與NF-κB通路的影響.pdf

1、目的：建立小鼠內(nèi)毒素（即脂多糖，LPS）急性腎損傷（ALI）模型，動(dòng)態(tài)觀察槐定堿對(duì)小鼠內(nèi)毒素性腎損傷模型的治療作用，研究槐定堿對(duì)LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的識(shí)別受體LBP、CD14、TLR4，胞內(nèi)NF-κB通路中IKK、IκB信號(hào)分子、核因子κB及主要炎癥介質(zhì)TNF-α的影響，以探討其抗內(nèi)毒素的藥理機(jī)制。 方法：BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組、內(nèi)毒素腎損傷LPS組、槐定堿治療組槐定堿高（12mg/kg）、中（6mg/kg）

2、、低（3mg/kg）三個(gè)劑量、槐定堿藥物對(duì)照組（12mg/kg）。每組小鼠再分為2h、6h、12h、24h 四個(gè)時(shí)間點(diǎn)。以尾靜脈注射內(nèi)毒素7mg/kg制備急性腎損傷小鼠模型。各組小鼠分別在處理完畢后的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，即2h、6h、12h、24h時(shí)記錄一般狀況并取材，肉眼及光鏡觀察腎組織的病理變化；尿酶法測(cè)定血清尿素氮(BUN)含量；放射免疫分析法檢測(cè)血清腫瘤壞死因子（TNF-α）含量；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)腎組織中LBP、C

3、D14、TLR4、IKK-β、IκB-β、P65及 TNF-α的 mRNA 表達(dá)水平；免疫印跡法（Western-blot）檢測(cè)腎組織中P65蛋白的表達(dá)水平。免疫組化SABC法檢測(cè)腎組織中磷酸化IKK和P65蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果： （1）內(nèi)毒素腎損傷LPS組小鼠在給予LPS后30分鐘即有癥狀出現(xiàn)，至24h未見緩解；肉眼與光鏡觀察腎臟病理改變，發(fā)現(xiàn)6h起腎臟出現(xiàn)光鏡可見的病理改變，12h時(shí)肉眼可察見病變，并逐漸加重，至2

4、4h均最為嚴(yán)重；血清BUN值自2h開始呈現(xiàn)持續(xù)性升高，至24h仍未見下降跡象（均P<0.05）。血清TNF-α 2h開始升高，6小時(shí)即達(dá)高峰，12h開始緩慢下降，但直至24h仍較同時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組顯著增高（均P<0.01）。 LPS組腎組織LBPmRNA、CD14mRNA與TLR4mRNA表達(dá)均在2h開始上調(diào)，分別于6h或12h達(dá)高峰，至24h仍維持高水平（均P<0.05）。 LPS組腎組織IKK-β、IκB-β的mRN

5、A與2h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到高峰，之后開始下降，24h時(shí)間點(diǎn)仍然明顯高于正常對(duì)照組。LPS組NF-κB P65的mRNA和蛋白明顯升高分別于6h和12h達(dá)到高峰，至24h時(shí)間點(diǎn)有所下降但仍高于同時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組（P<0.01）免疫組化檢測(cè)免疫組化檢測(cè)LPS組P65和磷酸化IKK蛋白表達(dá)的IOD值顯示呈持續(xù)性升高。 （2）槐定堿三個(gè)劑量均不同程度改善內(nèi)毒素性腎損傷小鼠的一般狀況，減輕腎組織病理?yè)p傷；槐定堿三個(gè)劑量治療組BUN值的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)

6、與LPS組類似，均自2h開始呈現(xiàn)持續(xù)升高，但與LPS組不同的是12h后三個(gè)劑量治療組的BUN值均迅速下降，至24h時(shí)均已降至正常水平?；倍▔A中、高劑量治療組小鼠血清TNF-α水平均顯著低于同時(shí)間點(diǎn)LPS組（P<0.01或P<0.05）。 與LPS組比較，槐定堿三個(gè)劑量治療組均不同程度顯著下調(diào)同時(shí)間點(diǎn)LBP、CD14、TLR4的mRNA表達(dá)。 與LPS組比較，槐定堿三個(gè)劑量治療組均不同程度顯著下調(diào)同時(shí)間點(diǎn)IKK-β、IκB

7、-β、及NF-κB P65的mRNA表達(dá)。免疫組化檢測(cè)磷酸化IKK蛋白表達(dá)的IOD值顯示槐定堿中、低劑量治療組在6h、12h、24h時(shí)間點(diǎn)均顯著下調(diào)了磷酸化IKK蛋白的表達(dá)；而且中劑量組24h時(shí)間點(diǎn)的磷酸化IKK蛋白表達(dá)已與同時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P>0.05）。 Western-blot檢測(cè)顯示槐定堿治療中劑量組各時(shí)間點(diǎn)P65蛋白表達(dá)均較同時(shí)間點(diǎn)LPS組顯著降低（P<0.05），并在24h時(shí)間點(diǎn)已與同時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組無(wú)

8、顯著差異。而高、低劑量組僅在部分時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)顯著下調(diào)作用（P<0.05）。免疫組化檢測(cè)顯示槐定堿各治療組與LPS組同時(shí)間點(diǎn)相比P65胞漿表達(dá)及核易位均有所減弱。 結(jié)論： （1）觀察了LPS所致內(nèi)毒素血癥急性腎損傷小鼠2h、6h、12h和24h的一般狀況、腎組織病理?yè)p傷情況、血清BUN、TNF-α含量、腎組織LBP、CD14、TLR4、IKK、IκB-β、NF-κB P65 及TNF-α mRNA表達(dá)水平、腎組織NF-κB

9、P65與磷酸化IKK蛋白表達(dá)的變化趨勢(shì)。 （2）槐定堿高（12mg/kg）、中（6mg/kg）、低（3mg/kg）三個(gè)劑量干預(yù)治療對(duì)內(nèi)毒素血癥急性腎損傷小鼠具有明顯保護(hù)作用。 （3）槐定堿的抗內(nèi)毒素腎損傷機(jī)制與抑制下游炎癥因子TNF-α的釋放有關(guān)，其作用可能通過(guò)下調(diào)模型小鼠腎組織LPS識(shí)別受體LBP、CD14、TLR4的表達(dá)、下調(diào)NF-κB通路中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子IKK-β、IκB-β、NF-κB p65的表達(dá)，抑制腎組織中I