槐定堿對內毒素肺損傷小鼠LPS識別受體及P38MAPK-AP-1信號通路的影響.pdf

1、目的： 建立小鼠內毒素（即脂多糖，LPS）急性肺損傷（ALI）模型，動態(tài)觀察槐定堿對小鼠內毒素性肺損傷模型的治療作用，研究槐定堿對LPS信號轉導途徑中的識別受體-LBP、CD14、TLR4、胞內p38MAPK信號分子、核轉錄因子AP-1及主要炎癥介質TNF-a、NO四個層次的影響，以探討其抗內毒素的藥理機制。 方法： BALB/c小鼠隨機分為6組，即正常對照組、內毒素肺損傷模型組、槐定堿治療組[槐定堿高（12mg

2、/kg）、中（6mg/kg）、低（3mg/kg）三個劑量]、槐定堿藥物對照組（12mg/kg ）。每組小鼠再分為2h、6h、12h、24h 四個時相。以尾靜脈注射內毒素7mg/kg 制備急性肺損傷小鼠模型。各組小鼠分別在給予 LPS 或槐定堿后相應時間點，即2h、6h、12h、24h時記錄一般狀況并取材，肉眼及光鏡觀察肺組織的病理變化；以肺濕/干重（W/D ）比值檢測肺水含量；硝酸還原酶法測定血清一氧化氮(NO)含量；放射免疫分析法檢測

3、血清腫瘤壞死因子（TNF-a）含量；逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測肺組織中LBP、CD14、TLR4、c-jun、c-fos及TNF-a的mRNA 表達水平；免疫組化SP法與免疫印跡法（Western-blot）檢測肺組織中總p38MAPK、磷酸化p38 MAPK、TLR4蛋白的表達水平。 結果： （1 ）內毒素肺損傷模型組小鼠在給予LPS 后30 分鐘即有癥狀出現(xiàn)，至24h未見緩解；肉眼與光鏡觀察肺臟病理改變，

4、發(fā)現(xiàn)6h 起肺臟病理改變明顯可見并逐漸加重，延至24h 亦未見減輕；模型鼠肺組織W/D 值顯著升高；血清TNF-a和NO 值均在給予LPS 后2h 即顯著升高，并分別在6h和12h 達到高峰，直至24h 仍明顯高于正常對照組（P<0.01）。模型組肺組織LBPmRNA、CD14mRNA 與TLR4mRNA 表達均在 2h 開始上調，于6h 達高峰，至24h 仍維持高水平。TLR4蛋白表達趨勢與TLR4mRNA大致相似。免疫組化檢測模型組

5、各時相點的p38 陽性細胞主要分布在氣道黏膜上皮細胞、浸潤的炎細胞和血管內皮細胞的胞漿中；磷酸化p38 在上述細胞的胞漿與胞核中均呈強陽性表達，陽性細胞數(shù)和陽性信號均較正常對照組明顯增多和增強，各時相點記分值均顯著高于同時相點正常對照組（P<0.01 或P<0.05 ）。Western-blot檢測模型組總p38蛋白，僅在2h、6h時相點較正常對照組顯著增高（P<0.05和P<0.01）；而磷酸化p38 在正常對照組與槐定堿對照組均表達

6、極低（未統(tǒng)計），模型組在LPS 刺激后2h迅速達到高峰，持續(xù)至6h，隨后開始降低，至24h 仍有表達。模型組肺組織中c-jun mRNA表達在2h 開始上調，6h 與12h時繼續(xù)升高，與同時相正常組比較差異顯著（P<0.01），但24h 已降至正常水平；模型組c-fos mRNA 表達2h 即達頂峰，隨后開始下降，但均明顯高于正常對照組（P<0.01 或P<0.05），24h時降至正常水平。肺組織中TNF-a mRNA變化趨勢與血清TN

7、F-a基本一致。 （2 ）槐定堿三個劑量均不同程度改善內毒素性肺損傷小鼠的一般狀況，減輕肺組織病理損傷，明顯降低肺組織W/D 值；除2h 低劑量組外，槐定堿三個劑量治療組血清NO 含量均顯著低于同時相點LPS模型組（均P<0.01）；槐定堿中、高劑量治療組小鼠血清TNF-a 水平均顯著低于同時相點LPS模型組（P<0.01 或P<0.05）。與LPS模型組比較，槐定堿三個劑量治療組均不同程度顯著下調同時相點LBP、CD14、TL

8、R4的mRNA以及TLR4蛋白的表達；免疫組化檢測槐定堿三個劑量治療組肺組織總p38，陽性細胞數(shù)與陽性信號強度的記分值與同時相點LPS組比較均無顯著差異；但磷酸化p38陽性細胞顯著減少，陽性信號明顯減弱，記分值均顯著小于同時相點LPS模型組(P<0.01 或P<0.05)。Western-blot檢測槐定堿三個劑量組肺組織總p38蛋白表達均與模型組無顯著差異，但槐定堿三個劑量治療組2h 起即有下調磷酸化p38蛋白表達的趨勢，6h 與12

9、h時與同時相點模型組比較均有顯著下降（P<0.01 或P<0.05）?；倍▔A三個劑量治療組均不同程度顯著下調c-jun和c-fos的mRNA表達（P<0.01 或P<0.05 ）?；倍▔A三個劑量治療組TNF-a mRNA表達的動態(tài)變化與血清TNF-a類似。槐定堿三個劑量治療組之間比較，在6h、12h 及24h時相點，中、高劑量組TNF-a mRNA表達均顯著低于同時相點低劑量組（P<0.01 或P<0.05），說明槐定堿中、高劑量組下調

10、TNF-a mRNA的效應強于低劑量組。 結論： （1）獲得內毒素急性肺損傷小鼠模型24h 內一般狀況、肺水含量、肺組織病理損傷情況、血清NO、TNF-a 含量、肺組織LBP、CD14、TLR4、c-jun、c-fos 及TNF-a mRNA 表達水平、肺組織TLR4、總p38 與磷酸化p38蛋白表達的動態(tài)變化數(shù)據(jù)。（2）槐定堿高（12mg/kg）、中（6mg/kg）、低（3mg/kg）三個劑量對內毒素急性肺損傷小鼠模型

11、具有治療效應。（3）槐定堿的抗內毒素肺損傷機制與下調LPS 識別受體LBP、CD14、TLR4 表達，抑制肺組織中p38 MAPK的磷酸化，干預核因子c-jun和c-fos基因的轉錄，抑制下游炎癥因子TNF-a、NO的釋放有關。（4）在本研究中，槐定堿下調TNF-a 表達的作用具有劑量依賴性，即中、高劑量的效應強于低劑量?；倍▔A三個劑量組之間其余觀測指標均無顯著的劑量依賴性。（5）本研究中槐定堿藥物對照組與正常對照組之間所有檢測數(shù)據(jù)均無