ZAG對(duì)LPS誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的NF-κB炎癥信號(hào)通路的影響及機(jī)制.pdf

1、第一部分人鋅alpha-2糖蛋白真核載體的建立及ZAG對(duì)LPS誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的TNF-α的影響
　　目的：
　　構(gòu)建重組人鋅 alpha-2糖蛋白(Zinc-α2-glycoprotein，ZAG)真核表達(dá)載體，并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，探討ZAG對(duì)LPS誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中的炎癥細(xì)胞因子TNF-α的影響。
　　方法：
　　1、提取HepG2細(xì)胞總RNA，RT-PCR法擴(kuò)增hZAG全基因表達(dá)序列，雙酶切法

2、將擴(kuò)增后的hZAG全基因表達(dá)序列插入表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-ZsGreen1中構(gòu)建pIRES2-ZsGreen1(-)-hZAG真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴(kuò)增方法和核苷酸測(cè)序驗(yàn)證后通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 pIRES2-ZsGreen1-hZAG序列瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，使用熒光倒置顯微鏡觀察瞬時(shí)表達(dá)及轉(zhuǎn)染效率，提取總RNA，RT-PCR檢測(cè)hZAG表達(dá)情況。
　　2、體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，通過(guò)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pIRES2-ZsGreen1

3、-hZAG后，用脂多糖LPS（1μg/mL）分別干預(yù)0h，2h，4h，8h，12h，24h。提取總RNA，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)脂肪細(xì)胞因子ZAG和炎癥因子TNF-α的mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　成功克隆人ZAG cDNA全序列，在限制性核酸內(nèi)切酶SacII和XhoI的作用下，與pIRES2-ZsGreen1空白載體片段連接，構(gòu)建成pIRES2-ZsGreen1(-)-hZAG表達(dá)質(zhì)粒，并由核苷酸序列測(cè)定證實(shí)。pI

4、RES2-ZsGreen1(-)-hZAG成功瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中 ZAG基因表達(dá)明顯上調(diào)。選用LPS誘導(dǎo) HepG2細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，TNF-α的表達(dá)在2h明顯增高，過(guò)表達(dá)ZAG組TNF-α在2h表達(dá)較對(duì)照組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建hZAG真核表達(dá)載體，建立過(guò)表達(dá)ZAG的HepG2細(xì)胞系。
　　2、ZAG過(guò)表達(dá)可以降低LPS誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中炎癥因子T

5、NF-α的表達(dá)。
　　第二部分鋅 alpha-2糖蛋白抑制LPS誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞NF-κB炎癥信號(hào)通路的研究
　　目的：
　　探討鋅α2糖蛋白(Zinc-α2-glycoprotein，ZAG)對(duì)LPS誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞NF-κB炎癥信號(hào)通路的影響。
　　方法：
　　培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，通過(guò)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pIRES2-ZsGreen1-hZAG后，并分別用LPS聯(lián)合NF-κB抑制劑BAY11-7082

6、干預(yù)，應(yīng)用Western blot檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子激酶IKKβ、核轉(zhuǎn)錄因子P65、核轉(zhuǎn)錄因子P50的表達(dá)。應(yīng)用免疫熒光方法觀察在LPS干預(yù)下的磷酸化P65核移位情況。
　　結(jié)果：
　　1、Western blot法顯示在無(wú)藥物干預(yù)的情況下，ZAG組中NF-κB相關(guān)因子表達(dá)無(wú)明顯差異；在LPS干預(yù)下誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)后，ZAG組中IKKβ、p65、p50的表達(dá)較對(duì)照組及空白質(zhì)粒組具有明顯差異；在 NF-κB抑制劑BAY11-7082和

7、LPS的聯(lián)合作用下，ZAG能增強(qiáng)BAY11-7082的抑制作用，降低IKKβ、p65、p50的蛋白表達(dá)。
　　2、采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)證實(shí)在未轉(zhuǎn)染組中，LPS刺激后磷酸化 P65具有明顯核移位的趨勢(shì)；在 ZAG組的細(xì)胞中,磷酸化 p65的核移位被抑制，在NF-κB抑制劑BAY11-7082和LPS的聯(lián)合作用下，ZAG能增強(qiáng)BAY11-7082的抑制作用，抑制磷酸化P65的核移位。
　　結(jié)論：
　　ZAG能夠抑制由LPS