外源性磷酸肌酸對(duì)未成熟心肌保護(hù)作用研究.pdf

1、研究背景:近20年來(lái)，心肌缺血再灌注損傷機(jī)制和心肌保護(hù)措施的研究取得了很大的進(jìn)展，并促進(jìn)了心血管外科的發(fā)展。然而，臨床上，一些嬰幼兒先天性心臟病，即使已成功地做了畸形矯治手術(shù)，但術(shù)后仍出現(xiàn)心功能不全，手術(shù)死亡率較高。有研究者指出，其一半原因應(yīng)歸咎于不恰當(dāng)?shù)男募”Ｗo(hù)。人們逐漸意識(shí)到廣泛應(yīng)用于臨床，并對(duì)成人心肌有良好保護(hù)作用的冷晶體停跳液，在嬰幼兒未成熟心肌卻不太理想。未成熟心肌作為心肌發(fā)育學(xué)上一個(gè)獨(dú)特的階段與成熟心肌在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能、

2、物質(zhì)代謝及基因表達(dá)等方面存在一定差異，成熟心肌的保護(hù)方法不能機(jī)械地用于未成熟心肌。在嬰幼兒先天性心臟病手術(shù)中，由于心肌保護(hù)不當(dāng)導(dǎo)致心功能不全是術(shù)后嬰幼兒早期死亡的主要原因之一。外源高能磷酸鹽能增強(qiáng)停跳液對(duì)成熟心肌的保護(hù)作用，但主要應(yīng)用于成年動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)病人，而在未成熟心肌國(guó)內(nèi)外研究尚少。此實(shí)驗(yàn)旨在觀察磷酸肌酸(CP)對(duì)未成熟心肌的保護(hù)作用。探討其對(duì)未成熟心肌及心肌間質(zhì)的保護(hù)機(jī)制以及對(duì)未成熟心肌細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步提高未成

3、熟心肌的保護(hù)效果。本研究分為二個(gè)部分：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究。 第一部分:動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一外:源性磷酸肌酸對(duì)未成熟兔心肌的保護(hù)研究 目的:觀察外源性磷酸肌酸(CP)對(duì)未成熟心肌的保護(hù)作用。 方法:出生3～4周齡的健康新生新西蘭長(zhǎng)耳大白兔18只，體重平均0.40kg，隨機(jī)分為3組，每組6只。Ⅰ組(對(duì)照組)：常規(guī)冷晶體心肌保護(hù)液組，建立Langendorff模型，灌流10min、工作心15min后，夾閉灌注管全心

4、停灌。主動(dòng)脈根部灌注ThomasⅡ冷晶體心肌保護(hù)液，灌注壓5.3kPa，按15ml/kg每隔30分鐘灌注一次，共3次，間隔期采用局部降溫維持心肌溫度9～11℃，缺血90分鐘。恢復(fù)Langendorff灌注10min，轉(zhuǎn)為工作心模型15min，記錄血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，取心肌標(biāo)本保存。Ⅱ組(CP組)：給予含10mmol/LCP(2.5g/L的ThomasⅡ冷晶體心肌保護(hù)液，劑量和用法均同Ⅰ組。Ⅲ組(CP+冷血停搏液組)：收集兔血，稀釋；添加CP

5、10mmol/L(2.5g/L)、ThomasⅡ冷晶體心肌保護(hù)液與兔血配成4：1含血停搏液，夾閉灌注管全心停灌后，立即用冷血停跳液灌注，缺血期灌注方式同Ⅰ組。分別測(cè)量以下指標(biāo)：血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、心肌含水量(MWC)、磷酸肌酶(CK)、磷酸肌酶同功酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)漏出率、心室肌ATP、ADP、AMP含量、肌鈣蛋白T(cTnT)、心肌超微結(jié)構(gòu)等。 結(jié)果:(1)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)中，主動(dòng)脈流量(AF)恢復(fù)率、冠脈流量(

6、CF)恢復(fù)率、心排量(CO)恢復(fù)率、左心室收縮壓(LVSP)恢復(fù)率、左心室舒張末壓(LVEDP)恢復(fù)率和±dp/dtmax恢復(fù)率CP組及CP+冷血停搏液組與對(duì)照組比較有明顯改善，CP組與CP+冷血停搏液組兩組比較無(wú)明顯差異；(2)心肌含水量(MWC)：CP組和CP+冷血停搏液組與對(duì)照組比較，再灌后含水量明顯減少；(3)CP組和CP+冷血停搏液組與對(duì)照組比較心肌乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、磷酸肌酶同功酶(CK-MB)、肌鈣蛋白

7、T(cTnT)漏出率明顯改善(P＜0.05)；(4)心肌組織ATP、ADP含量：CP組和CP+冷血停搏液組再灌后ATP含量與對(duì)照組比較明顯增高；(5)心肌超微結(jié)構(gòu)：CP組和CP+冷血停搏液組與對(duì)照組比較，心肌超微結(jié)構(gòu)損傷較輕。 結(jié)論:CP對(duì)缺血再灌注未成熟心肌具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制是通過(guò)維持缺血期間能量供應(yīng)，同時(shí)保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。 實(shí)驗(yàn)二:外源性磷酸肌酸對(duì)未成熟心肌的細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 目的:

8、觀察外源性磷酸肌酸對(duì)未成熟心肌的細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，從細(xì)胞凋亡及調(diào)控基因的角度探討CP保護(hù)未成熟心肌，減少心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。 方法:出生3～4周齡的健康新生新西蘭長(zhǎng)耳大白兔12只，體重平均0.40kg，隨機(jī)分為2組，每組6只。Ⅰ組(對(duì)照組)：常規(guī)冷晶體心肌保護(hù)液組，建立Langendorff模型，灌流10min、工作心15min后，夾閉灌注管全心停灌。主動(dòng)脈根部灌注ThomasⅡ冷晶體心肌保護(hù)液，灌注壓5.3

9、kPa，按15ml/kg每隔30分鐘灌注一次，共3次，間隔期采用局部維持心肌溫度9～11℃，缺血90分鐘。恢復(fù)Langendorff灌注10min，轉(zhuǎn)為工作心模型15min，取心肌標(biāo)本保存。Ⅱ組(CP組)：給予含10mmol/LCP(2.5g/L)的ThomasⅡ冷晶體心肌保護(hù)液，劑量和用法均同Ⅰ組。分別用缺口未端標(biāo)記(TUNEL)和免疫組化技術(shù)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Fas及FasL表達(dá)情況。 結(jié)果1、

10、TUNEL法顯示：CP可顯著降低心臟缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生率(6.4±2.97VS14.2±1.92，P＜0.01)。2、免疫組化顯示：參與心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Fas及FasL在各組均有表達(dá)，CP組Bcl-2表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性。而促凋亡因子Fas及Fas-L表達(dá)僅為弱陽(yáng)性。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CP組與對(duì)照組比較，在缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡明顯減少，bcl-2基因蛋白的表達(dá)明顯增多，而fas、fasL基因蛋白的表達(dá)明顯減少，說(shuō)

11、明在未成熟心肌，CP通過(guò)影響bcl-2、fas、fasL基因蛋白的表達(dá)而減少心肌細(xì)胞凋亡。 結(jié)論:CP可減輕心臟再灌注損傷引起心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能為：增加心臟再灌注后心肌細(xì)胞抗氧化能力、減少氧自由基生成、減輕自由基損傷、增加對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的抵抗力；同時(shí)，增加凋亡相關(guān)基因Bcl-2表達(dá)，降低Fas、FasL表達(dá)，從而減少心臟缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡。 第二部分:臨床研究外源性磷酸肌酸對(duì)嬰幼兒未成熟心肌的保護(hù)作用

12、目的:本研究旨在探討外源性磷酸肌酸(CP)對(duì)未成熟心肌的保護(hù)作用。 方法:1歲以內(nèi)的先天性心臟病患者共12例，隨機(jī)分為2組，Ⅰ組(對(duì)照組)、Ⅱ組(CP組)。Ⅰ組(對(duì)照組)：常規(guī)冷晶體心肌保護(hù)液組，常規(guī)建立主動(dòng)脈及上、下腔靜脈插管后開始體外循環(huán)，主動(dòng)脈阻斷后根部灌注ThomasⅡ冷晶體心肌保護(hù)液，第一次按30ml/kg，以后按15ml/kg每隔30分鐘灌注一次，記錄血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，取心肌標(biāo)本保存。Ⅱ組(CP組)：給予含10mmol

13、/LCP(2.5g/L)的ThomasⅡ冷晶體心肌保護(hù)液，劑量和用法均同Ⅰ組。分別測(cè)量以下指標(biāo)：記錄比較術(shù)前、后心率(HR)、記錄比較動(dòng)脈收縮壓(SAP)、動(dòng)脈舒張壓(DAP)、平均動(dòng)脈壓(MAP)、右心房平均壓(MRAP)，VSD的直徑等臨床資料。術(shù)中記錄體外循環(huán)轉(zhuǎn)流時(shí)間、主動(dòng)脈阻斷時(shí)間、主動(dòng)脈開放后輔助循環(huán)的時(shí)間，記錄心室恢復(fù)跳動(dòng)所需時(shí)間等心臟電生理指標(biāo)。記錄并比較兩組術(shù)后24小時(shí)內(nèi)正性肌力藥物多巴胺的用量。分別在術(shù)前、術(shù)畢、術(shù)后2

14、4小時(shí)抽取靜脈血測(cè)定肌酸激酶(CK)及其同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、心肌肌鈣蛋白T(cardiactroponinT，cTnT)的濃度。主動(dòng)脈阻斷前及主動(dòng)脈開放前心房肌ATP，ADP，AMP的變化。主動(dòng)脈開放后5～10分鐘取心房肌組織作原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)(Tunel)，取心室肌肉作透射電鏡觀察。 結(jié)果:術(shù)前年齡、體重、VSD大小、主動(dòng)脈阻斷時(shí)間、VSD的直徑兩組比較無(wú)明顯差異，兩組動(dòng)脈收縮壓(SAP)、動(dòng)脈舒張壓(

15、DAP)、平均動(dòng)脈壓(MAP)、右心房平均壓(MRAP)。術(shù)中體外循環(huán)轉(zhuǎn)流時(shí)間、主動(dòng)脈開放后輔助循環(huán)的時(shí)間等各項(xiàng)生理指標(biāo)資料比較亦無(wú)明顯差異、而比較心室復(fù)跳時(shí)間及術(shù)后24小時(shí)內(nèi)多巴胺的用量有明顯差異(P＜0.05)。比較兩組術(shù)畢、術(shù)后24小時(shí)CK、LDH無(wú)差異。CK-MB、cTnT兩組比較有明顯差異。心肌ATP，ADP顯示缺血后其含量CP組高于對(duì)照組(P＜0.05)的變化。心室肌電鏡顯示對(duì)照組肌絲溶解、線粒體空泡變，而CP組肌絲清晰，排