茉莉酸促進(jìn)棉花球形胚表皮細(xì)胞發(fā)育成體細(xì)胞胚的機(jī)理研究.pdf

1、棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，長(zhǎng)期以來，由于常規(guī)的棉花育種對(duì)目標(biāo)性狀的選擇較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，已不能滿足市場(chǎng)需求，隨著棉花細(xì)胞工程和基因工程研究的深入，給常規(guī)育種技術(shù)注入了新鮮血液，彌補(bǔ)了常規(guī)育種的不足，其中棉花的轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)發(fā)展尤為迅速。棉花的體細(xì)胞胚胎發(fā)生再生途徑是研究棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，棉花體細(xì)胞胚形成的前期，特別是在球形胚時(shí)期，培養(yǎng)基中添加茉莉酸能使原球形胚產(chǎn)生大量的次生胚。本論文針對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行了系統(tǒng)研究。為使用球形胚為外植

2、體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化基因提供實(shí)際可能性。
　　1.茉莉酸在合適濃度下，能促進(jìn)球形胚類表皮細(xì)胞發(fā)育成體細(xì)胞胚。通過體視顯微鏡、掃描電鏡、石蠟切片觀察經(jīng)茉莉酸處理的球形胚，發(fā)現(xiàn)次生胚是從球形胚的類表皮細(xì)胞發(fā)育而來，主要發(fā)生位置在胚軸部位。次生胚與原球形胚的組織學(xué)觀察及后續(xù)發(fā)育均無顯著差異，均可以發(fā)育為再生植株；
　　2.JA合成途徑限速酶AOS在體細(xì)胞胚發(fā)育中的表達(dá)分析。JA在調(diào)控棉花體細(xì)胞胚增殖方面有重要作用，而 AOS是植物

3、 JA合成途徑中的關(guān)鍵酶。鑒定了在胚發(fā)育過程中表達(dá)的 AOS基因，依據(jù)熒光定量分析結(jié)果，可以將這些基因的表達(dá)模式主要分為3類，一類是 GhAOS1和GhAOS6在棉花胚發(fā)育過程中表達(dá)量相對(duì)較高，另一類是GhAOS2和GhAOS3在棉花愈傷和胚性愈傷中表達(dá)量相對(duì)較高，第三類是GhAOS4和GhAOS5在莖和葉中表達(dá)水平相對(duì)較高。這些基因的表達(dá)有時(shí)空特異性，且GhAOS1和GhAOS6可能在棉花胚發(fā)育中發(fā)揮重要作用。亞細(xì)胞定位分析顯示，大部

4、分基因被定位在過氧化物酶體中，可能參與調(diào)控光呼吸、體細(xì)胞胚成熟和萌發(fā)。對(duì)其啟動(dòng)子元件分析發(fā)現(xiàn)，它們可能受激素和脅迫的調(diào)控在體細(xì)胞胚胎發(fā)生中起作用。為進(jìn)一步研究AOS基因家族在棉花體細(xì)胞胚發(fā)育中的功能奠定了基礎(chǔ)；
　　3.通過對(duì)AOS基因的染色體位置、亞細(xì)胞定位、啟動(dòng)子和表達(dá)模式等的生物信息學(xué)分析，篩選出3個(gè)AOS基因GhAOS1、GhAOS2和GhAOS6，克隆基因，構(gòu)建過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入棉花。同時(shí)構(gòu)建VIGS干涉載體干涉棉花，我們發(fā)

5、現(xiàn)無論是過表達(dá)AOS抑或是干涉AOS基因，球形胚發(fā)育成次生胚的數(shù)量均沒有顯著差異，說明球形胚表皮細(xì)胞再發(fā)育成體細(xì)胞胚與AOS基因表達(dá)量關(guān)系不密切；
　　4. JA處理球形胚后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn)差異基因在0.5h時(shí)最多，且上調(diào)基因數(shù)大于下調(diào)基因數(shù)；與逆境脅迫相關(guān)的差異基因較為突出，尤其是激素相關(guān)的基因；逆境響應(yīng)的差異基因與生長(zhǎng)素、脫落酸、乙烯密切相關(guān)；我們主要針對(duì)激素響應(yīng)相關(guān)基因、壓力響應(yīng)相關(guān)基因以及體胚發(fā)育相關(guān)基因做了初步分