茉莉酸促進棉花球形胚表皮細胞發(fā)育成體細胞胚的機理研究.pdf

1、棉花是一種重要的經(jīng)濟作物，長期以來，由于常規(guī)的棉花育種對目標性狀的選擇較費時費力，已不能滿足市場需求，隨著棉花細胞工程和基因工程研究的深入，給常規(guī)育種技術(shù)注入了新鮮血液，彌補了常規(guī)育種的不足，其中棉花的轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)發(fā)展尤為迅速。棉花的體細胞胚胎發(fā)生再生途徑是研究棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，棉花體細胞胚形成的前期，特別是在球形胚時期，培養(yǎng)基中添加茉莉酸能使原球形胚產(chǎn)生大量的次生胚。本論文針對這一現(xiàn)象進行了系統(tǒng)研究。為使用球形胚為外植

2、體進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化基因提供實際可能性。
　　1.茉莉酸在合適濃度下，能促進球形胚類表皮細胞發(fā)育成體細胞胚。通過體視顯微鏡、掃描電鏡、石蠟切片觀察經(jīng)茉莉酸處理的球形胚，發(fā)現(xiàn)次生胚是從球形胚的類表皮細胞發(fā)育而來，主要發(fā)生位置在胚軸部位。次生胚與原球形胚的組織學(xué)觀察及后續(xù)發(fā)育均無顯著差異，均可以發(fā)育為再生植株；
　　2.JA合成途徑限速酶AOS在體細胞胚發(fā)育中的表達分析。JA在調(diào)控棉花體細胞胚增殖方面有重要作用，而 AOS是植物

3、 JA合成途徑中的關(guān)鍵酶。鑒定了在胚發(fā)育過程中表達的 AOS基因，依據(jù)熒光定量分析結(jié)果，可以將這些基因的表達模式主要分為3類，一類是 GhAOS1和GhAOS6在棉花胚發(fā)育過程中表達量相對較高，另一類是GhAOS2和GhAOS3在棉花愈傷和胚性愈傷中表達量相對較高，第三類是GhAOS4和GhAOS5在莖和葉中表達水平相對較高。這些基因的表達有時空特異性，且GhAOS1和GhAOS6可能在棉花胚發(fā)育中發(fā)揮重要作用。亞細胞定位分析顯示，大部

4、分基因被定位在過氧化物酶體中，可能參與調(diào)控光呼吸、體細胞胚成熟和萌發(fā)。對其啟動子元件分析發(fā)現(xiàn)，它們可能受激素和脅迫的調(diào)控在體細胞胚胎發(fā)生中起作用。為進一步研究AOS基因家族在棉花體細胞胚發(fā)育中的功能奠定了基礎(chǔ)；
　　3.通過對AOS基因的染色體位置、亞細胞定位、啟動子和表達模式等的生物信息學(xué)分析，篩選出3個AOS基因GhAOS1、GhAOS2和GhAOS6，克隆基因，構(gòu)建過表達載體轉(zhuǎn)入棉花。同時構(gòu)建VIGS干涉載體干涉棉花，我們發(fā)

5、現(xiàn)無論是過表達AOS抑或是干涉AOS基因，球形胚發(fā)育成次生胚的數(shù)量均沒有顯著差異，說明球形胚表皮細胞再發(fā)育成體細胞胚與AOS基因表達量關(guān)系不密切；
　　4. JA處理球形胚后進行轉(zhuǎn)錄組測序，分析發(fā)現(xiàn)差異基因在0.5h時最多，且上調(diào)基因數(shù)大于下調(diào)基因數(shù)；與逆境脅迫相關(guān)的差異基因較為突出，尤其是激素相關(guān)的基因；逆境響應(yīng)的差異基因與生長素、脫落酸、乙烯密切相關(guān)；我們主要針對激素響應(yīng)相關(guān)基因、壓力響應(yīng)相關(guān)基因以及體胚發(fā)育相關(guān)基因做了初步分