ADAR1和ADAR2通過對MAVS基因的3＇UTR進(jìn)行RNA編輯影響HBV表達(dá)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　據(jù)統(tǒng)計在世界范圍內(nèi)慢性乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)攜帶者的數(shù)量超過3.5億人，而在中國乙肝病毒攜帶者約為1.3億人，慢性HBV感染已嚴(yán)重威脅著中國人民的健康。在感染HBV病毒后，約有10％的感染者會發(fā)展成慢性感染，病毒的持續(xù)性復(fù)制會引起肝細(xì)胞的損傷、壞死及變性，這其中有15％～40％會進(jìn)一步發(fā)展成肝硬化和肝癌。因此，HBV感染引發(fā)的慢性乙肝進(jìn)一步導(dǎo)致肝硬化和肝癌是中國肝癌發(fā)生的重要模式途徑。而

2、研究表明，病毒因素、環(huán)境因素及宿主的遺傳因素相互作用，影響著HBV感染的結(jié)果。因此，HBV復(fù)制表達(dá)相關(guān)調(diào)控基因及HBV治療途徑的研究具有重大意義。本研究初步探究ADAR家族通過對機(jī)體的RNA進(jìn)行編輯，改變機(jī)體及病毒基因的表達(dá)從而對乙肝病毒的復(fù)制發(fā)揮影響。
　　方法：
　　首先利用轉(zhuǎn)錄組測序、桑格測序和焦磷酸測序的方法分析，篩選出線粒體抗病毒信號蛋白MAVS基因的3'UTR上可能存在由ADAR1和ADAR2介導(dǎo)的非SNP的A-

3、to-G的編輯變化位點(diǎn);構(gòu)建MAVS基因的3'UTR雙熒光素酶質(zhì)粒，探究RNA編輯功能改變基因的3'UTR對此基因表達(dá)的影響;再從mRNA和蛋白水平進(jìn)一步探究ADAR家族和MAVS二者的關(guān)系;構(gòu)建MAVS基因的CDS過表達(dá)質(zhì)粒和sh-RNA敲低質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染進(jìn)含HBV全基因組HepG2.2.15細(xì)胞系，通過ELISA和實時熒光定量PCR方法檢測細(xì)胞內(nèi)及上清中HBsAg、HBeAg、HBV DNA、HBV cccDNA、3.5kb HBV

4、 RNA、total HBV RNA和HB c蛋白等HBV標(biāo)志物水平，以檢測驗證此基因在HBV感染中是否發(fā)揮作用。
　　結(jié)果：
　　1.測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAVS的chr20:3869744和chr20:3870562位點(diǎn)可能為ADAR1和ADAR2的RNA編輯位點(diǎn)。
　　2.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻?，MAVS基因的3'UTR的正常型A位點(diǎn)質(zhì)粒表達(dá)活性顯著高于編輯型G位點(diǎn)(P＜0.05)，尤其在HBV陽性細(xì)胞HepG2.2

5、.15中。
　　3.蛋白水平和mRNA水平驗證發(fā)現(xiàn)ADAR1和ADAR2基因的表達(dá)，使MAVS的mRNA和編碼蛋白的表達(dá)水平分別顯著下降(P＜0.05)。
　　4.MAVS對HBV表達(dá)的影響檢測提示，上調(diào)MAVS表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)基上清中的HBV標(biāo)志物表達(dá)均顯著減少(P＜0.05)，下調(diào)MAVS表達(dá)，則HBV標(biāo)志物表達(dá)均穩(wěn)定顯著上升(P＜0.05);
　　5.共轉(zhuǎn)染ADAR1和MAVS的過表達(dá)和干擾質(zhì)粒實驗發(fā)現(xiàn)，共同過

6、表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)基上清中的HBV標(biāo)志物表達(dá)均顯著減少(P＜0.05);共同下調(diào)表達(dá)，HBV標(biāo)志物表達(dá)無明顯變化區(qū)別。
　　6.蛋白水平結(jié)果表明，在HBV陽性細(xì)胞系HepG2.2.15中加入干擾素IFNα后，MAVS的表達(dá)顯著降低(P＜0.05);并且施加IFNα抗病毒的同時提高M(jìn)AVS的表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)及上清中的HBV標(biāo)志物表達(dá)降低更顯著(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.轉(zhuǎn)錄組測序分析及焦磷酸測序驗證提示，MAV

7、S基因可能受ADAR1和ADAR2的RNA編輯影響;
　　2.雙熒光素酶實驗提示，MAVS的chr20:3869744和chr20:3870562位點(diǎn)被編輯后使基因表達(dá)活性低。
　　3.HBV標(biāo)志物表達(dá)檢測結(jié)果提示，MAVS的表達(dá)可能抑制HBV病毒的復(fù)制和表達(dá)。
　　4.蛋白及mRNA水平結(jié)果提示，IFNα和ADAR1可能抑制線粒體抗病毒信號蛋白MAVS的表達(dá)，從而對HBV病毒的復(fù)制產(chǎn)生影響。
　　5.施加IFN