山藥基源植物分子鑒別體系建立與珠芽相關基因的轉錄組分析.pdf

1、山藥(Dioscorea.opposita Thunb.)是中國的傳統(tǒng)藥材，其基源植物為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(Dioscorea Linn.)植物薯蕷(D.opposita Thunb.在《Flora ofChina》中，已將其正名為D.polystachya Turcz.)，在其所有品種中又以鐵棍山藥(D.polystachya‘Tiegun’)為最佳，目前公認的道地性產(chǎn)區(qū)為河南溫縣。國內市場上山藥的基源植物存在

2、著三個亂象:薯蕷近緣種的冒充造成物種混亂、鐵棍山藥的冒充造成品種混亂以及非道地產(chǎn)區(qū)冒充河南溫縣鐵棍山藥所造成的產(chǎn)區(qū)混亂。傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒別對于山藥藥材及其基源植物難以鑒定，顯微鑒別需要較高的專業(yè)知識及復雜的操作技術，分子標記的指紋圖譜等傳統(tǒng)分子鑒定方法操作繁瑣、花費的成本較大，因此基于基源植物鑒定的山藥藥材需要一種簡單、快速和準確的方法。本研究搜集了山藥基源植物薯蕷5個易混近緣種、14個薯蕷主要品種以及8個鐵棍山藥主產(chǎn)區(qū)的實驗材料，分別在

3、物種、品種及區(qū)域特異性三個層面建立分子鑒別體系。
　　珠芽是薯蕷重要的營養(yǎng)器官和無性繁殖器官，但目前未見對其發(fā)生的分子機理的相關研究。本研究通過對產(chǎn)生珠芽的鐵棍山藥同株著生和不著生珠芽的葉腋、不產(chǎn)生珠芽的花籽山藥的葉腋等3個組織，進行轉錄組測序分析，旨在發(fā)掘參與珠芽發(fā)生的基因。具體研究的內容及結果如下:
　　(1)通過SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism)分子標記對薯蕷及5

4、個近緣種的遺傳多樣性研究發(fā)現(xiàn)，物種之間遺傳多樣性十分豐富:所篩選出的21對能擴增出清晰并呈現(xiàn)多態(tài)性條帶的引物組合總共擴增產(chǎn)生了355條重復性好、清晰的譜帶，其中338條帶為多態(tài)性帶，占總擴增條帶的95.27％;平均每對引物擴增16.90條帶譜和16.10條多態(tài)性帶。對遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性總位點系數(shù)為Na為1.8963，有效位點系數(shù)Ne為1.7506。遺傳多樣性指數(shù)H為0.4840，香農指數(shù)Ⅰ為0.6662。6個物種的總的雜合度H

5、t為0.4541，物種內的平均雜合度Hs為0.1661。物種間的Gst為0.5711，表明所有遺傳變異中的57.11％都出現(xiàn)在物種之間。物種之間存在較為豐富的基因交流(Nm=0.3754)的主要原因是野生薯蕷屬物種之間存在有性繁殖的方式。對物種之間的遺傳結構研究發(fā)現(xiàn)，日本薯蕷(D.japonica Thunb.)的Fis值最低，表明其種內分化程度最高，褐苞薯蕷(D.persimilis Prain&Burkill)的種內分化程度最低，山

6、薯(D.fordii Prain&Burkill)與其他5個物種的遺傳差異最大(Fst=0.155)，薯蕷與其它5個物種之間的遺傳差異最小(Fst=0.038)。對遺傳關系的研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷與日本薯蕷之間遺傳關系最近。本研究結合SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)標記開發(fā)的物種特異性鑒定SRAP-SCAR分子標記，能有效的將薯蕷從其近緣種中鑒定出來。
　　(2)利用ISAP(In

7、tron Sequence Amplified Polymorphism)分子標記對薯蕷14個品種進行了遺傳關系的分析，結果表明:11對ISAP引物共擴增出95條帶，其中91條(95.79％)為多態(tài)性帶。遺傳多樣性分析結果顯示薯蕷品種之間存在著豐富的遺傳多樣性:總位點系數(shù)Na變化范圍為1.8999到2.000，平均值為1.9651。有效位點Ne變化范圍為1.1529到1.4271，平均值為1.3018。，遺傳多樣性指數(shù)H變化范圍為0.1

8、327到0.2673，平均值為0.2002。香農指數(shù)Ⅰ變化范圍為0.2011到0.5832，平均值為0.3102。遺傳相似系數(shù)與遺傳距離分析結果表明，與鐵棍山藥遺傳關系由近到遠的品種分別為:太谷山藥、糙山藥、麻山藥、安順山藥、無架雙胞山藥、細長毛山藥、米山藥、華鎣山藥、花籽山藥、小白嘴山藥、粗牛腿山藥、九斤黃及白玉山藥。薯蕷品種遺傳關系分析表明，薯蕷品種之間可以明顯的分成兩大支，并且與形態(tài)學特征相關。從11對引物中篩選出1對鐵棍山藥的特

9、異性引物，擴增得到1條大為435bp的特異性片段。對14個品種140個單株植物進行驗證的結果顯示鐵棍山藥10個單株全部在435bp處出現(xiàn)SCAR特異帶，其他13個品種沒有出現(xiàn)此帶。因此本研究開發(fā)的ISAP-SCAR標記可以作為鐵棍山藥的特異分子標記，用來鑒別鐵棍山藥。
　　(3)利用ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat）分子標記對鐵棍山藥8個產(chǎn)區(qū)的產(chǎn)品的遺傳多樣性特征進行分析，結果表明:遺傳多樣性總位

10、點系數(shù)Na變化范圍從1.7789到2.0000，有效位點Ne變化范圍為1.0417到1.5503，遺傳多樣性指數(shù)H為0.0794到0.3751以及香農指數(shù)Ⅰ變化范圍為0.1864到0.5388，表明了區(qū)域之間存在較為豐富的遺傳多樣性水平。對區(qū)域之間的遺傳關系研究發(fā)現(xiàn)，與河南溫縣產(chǎn)區(qū)遺傳關系由近到遠的地區(qū)分別是江蘇徐州、山西太原、山東濟寧、湖南瀏陽、河北滄州、四川南充和廣東東莞，產(chǎn)區(qū)間遺傳關系的遠近與引種年限有關。利用SCAR(Seque

11、nceCharacterized Amplified Region)技術進行鐵棍山藥的區(qū)域特異性相關的分子鑒別研究，通過ISSR擴增，在引物ISSR4(ACACACACACACACACC)的擴增產(chǎn)物中獲得河南溫縣鐵棍山藥的特異性譜帶，再將這個條帶轉化為SCAR標記并進行單株檢測，結果表明與河南溫縣鐵棍山藥的ISSR-SCAR標記在廣東東莞、山東濟寧、四川南充、湖南瀏陽、山西太原產(chǎn)區(qū)中未出現(xiàn)，證明與這個標記能準確鑒別引種時間較長的非道地產(chǎn)

12、區(qū)的鐵棍山藥。
　　利用三種分子標記的數(shù)據(jù)對薯蕷不同區(qū)域、不同品種及不同物種進行聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，薯蕷及其近緣種在系統(tǒng)樹上的位置與單獨使用SRAP標記的分析結果相似:與薯蕷遺傳關系由近到遠的物種依次是日本薯蕷、參薯、無翅參薯、褐苞薯蕷和山薯。
　　(4)本研究通過對鐵棍山藥同株生成珠芽、不生成珠芽及花籽山藥不生成珠芽等3個組織進行轉錄組測序，結果為:共得到Unigene70480個，對轉錄組的差異基因分析表明，鐵棍山藥不生成珠芽

13、的組織相對于生成珠芽的組織，共有6263個Urigene表達上調，有8929個Unigene表達下調;鐵棍山藥生成珠芽的組織相對于花籽山藥，共有13026個Unigene表達上調，有11352個Unigene表達下調。鐵棍山藥生成珠芽的組織同時相對于其不生成珠芽的部分及花籽山藥共有2698個Unigene上調，4949個Unigene下調。將差異基因在多個數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，最終得到這些Unigenes的注釋信息。依據(jù)已報道的調

14、控龍舌蘭(Agave tequilana Linn.)、臺閩苣苔(Titanotrichum oldhamii(Hemsley) Solereder)珠芽發(fā)生的關鍵基因，并結合調控植物側枝形成的關鍵基因等，最終選擇23個可能參與薯蕷珠芽發(fā)生的候選基因。此外，本研究基于轉錄組數(shù)據(jù)的SSR(simple sequence repeats)位點分布特征開發(fā)得到11102對SSR引物，為進一步的薯蕷育種和遺傳圖譜構建等工作提供更加豐富的標記選擇