協(xié)同信號分子B7-H3對肺炎球菌腦膜炎小鼠趨化因子KC、MIP-2及TLR2蛋白表達的影響.pdf

1、實驗?zāi)康模?br>　　細菌性腦膜炎是兒童時期較嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，近年來，盡管以抗生素為主導(dǎo)的治療手段使細菌性腦膜炎預(yù)后已大為改觀，但是該病目前仍有較高的死亡率和致殘率，因此進一步研究細菌性腦膜炎的免疫病理機制，尋找新的干預(yù)手段意義重大。細菌性腦膜炎最顯著的病理特征之一是由于外周血大量的炎癥細胞在趨化因子的作用下，穿越血腦屏障，向腦內(nèi)遷移和聚集。因此，炎性趨化因子在介導(dǎo)細菌性腦膜炎的免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮舉足輕重的作用。角蛋白趨化因子

2、（Keratinocyte chemoattractant，KC）和巨噬細胞炎癥蛋白2（Macrophage-inflammatory protein2， MIP-2）是CXC類趨化因子中的重要成員，在機體免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。協(xié)同信號分子是介導(dǎo)抗感染免疫應(yīng)答過程的重要成分，B7同源性3（B7 Homology3， B7-H3）是 B7家族的新成員，其在抗感染免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)控作用。本研究在我們前期發(fā)現(xiàn)細菌性腦膜炎患

3、兒體內(nèi)可溶性 B7-H3分子異常高表達的基礎(chǔ)上，通過體內(nèi)外實驗觀察B7-H3對細菌性腦膜炎動物模型中趨化因子KC、MIP-2及TLR2（Toll-like receptor2）蛋白表達的影響，探討B(tài)7-H3在細菌性腦膜炎炎癥趨化作用的影響，了解其在細菌性腦膜炎病情進展中的作用，以期為細菌性腦膜炎的免疫干預(yù)提供新的思路和實驗依據(jù)。
　　實驗方法：
　　1、體內(nèi)試驗，研究B7-H3對肺炎鏈球菌腦膜炎小鼠神經(jīng)行為學(xué)改變、體質(zhì)量的變

4、化和腦組織勻漿中趨化因子KC、MIP-2 mRNA相對表達量及TLR2蛋白的表達的影響。取月齡為1.5-2月的健康雄性BALB/C小鼠48只，隨機分為4組：生理鹽水對照組（CON組）、B7-H3組（B7-H3組）、肺炎鏈球菌組（SP組）、肺炎鏈球菌+B7-H3蛋白組（SP+B7-H3組）；每組12只小鼠。腹腔注射誘導(dǎo)麻醉后，通過側(cè)腦室定位注入10μl無菌生理鹽水+5μl肺炎鏈球菌混懸液來建立小鼠細菌性腦膜炎模型；CON組注射15μl無菌

5、生理鹽水，B7-H3組注入10μlB7-H3蛋白+5μl無菌生理鹽水，SP組注入10μl無菌生理鹽水+5μl肺炎鏈球菌混懸液，SP+B7-H3組注入10μlB7-H3蛋白+5μl肺炎鏈球菌混懸液。分別于側(cè)腦室注射后6h、24h對各組小鼠進行：1）神經(jīng)行為學(xué)評分、2）記錄體質(zhì)量的變化、3）HE染色方法觀察腦組織炎癥狀況、4）Real-time PCR方法檢測腦組織中趨化因子KC、MIP-2 mRNA的相對表達量、5）免疫組織化學(xué)方法檢測大

6、腦皮層中TLR2蛋白的表達。
　　2、體外實驗，研究 B7-H3對肺炎鏈球菌感染條件下小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)上清液中趨化因子KC、MIP-2表達的影響。選用生后1-3天的BALB/C新生小鼠，無菌條件下取腦組織，經(jīng)分離、培養(yǎng)、純化后獲得原代小膠質(zhì)細胞，接種于24孔培養(yǎng)板中，細胞密度為1×105/孔。實驗分組：對照組（CON組）、肺炎鏈球菌感染組（SP組）、肺炎鏈球菌+B7-H3蛋白組（SP+B7-H3組）,三組細胞體系中均加入等量的頭孢曲

7、松（濃度為100μg?ml-1）以抑制細菌的過度繁殖。分別在刺激后5h、24h、48h收集細胞培養(yǎng)上清液，用ELISA方法檢測上清液中趨化因子KC、MIP-2的濃度變化。
　　實驗結(jié)果：
　　一、體內(nèi)試驗
　　1、神經(jīng)行為學(xué)評分：各組小鼠側(cè)腦室注射后6h、24h后進行神經(jīng)行為學(xué)評分， B7-H3組與 CON組相比6h（5.0±0）vs（5.0±0）、24h（5.0±0）vs（5.0±0），差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05

8、）；SP組評分相對CON組明顯降低6h（3.67±0.52）vs（5.0±0）、24h（2.0±0.63）vs（5.0±0），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而SP+B7-H3組相比SP組評分更低6h（2.83±0.75）vs（3.67±0.52）、24h（1.17±0.41） vs（2.0±0.63），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　2、體質(zhì)量變化比較：分別記錄各組小鼠側(cè)腦室注射前和注射后6h、24h體質(zhì)量的變化，

9、B7-H3組與CON組相比6h（0.06±0.27）vs（0.11±0.59）、24h（0.92±0.8） vs（0.04±0.93），差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；SP組體質(zhì)量相對 CON組降低明顯6h（0.99±0.21）vs（0.11±0.59）、24h（2.3±0.39）vs（0.04±0.93），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而SP+B7-H3組相比SP組體質(zhì)量明顯下降6h（1.51±0.44） vs（0.99±0.

10、21）、24h（2.68±0.18）vs（2.3±0.39），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　3、腦組織HE染色：在6h時，SP組相對于CON組軟腦膜血管充血明顯，蛛網(wǎng)膜下腔顯著擴張，腦膜及蛛網(wǎng)膜下腔有炎癥細胞浸潤；SP+B7-H3組相對于 SP組軟腦膜血管充血更加顯著，蛛網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)完整性破壞，蛛網(wǎng)膜下腔開放，腦膜及蛛網(wǎng)膜下腔大量炎癥細胞浸潤。
　　24h時，SP組相對于CON組軟腦膜血管充血較前明顯，蛛網(wǎng)膜下腔顯著

11、擴張，腦膜及蛛網(wǎng)膜下腔有炎癥細胞浸潤，SP+B7-H3組相對于 SP組軟腦膜血管充血更加顯著，蛛網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)完整性極度破壞，蛛網(wǎng)膜下腔開放，腦膜及蛛網(wǎng)膜下腔炎癥細胞浸潤加劇并伴有炎癥細胞向蛛網(wǎng)膜下腔外遷移。
　　4、腦組織勻漿Real-time PCR檢測KC、MIP-2 mRNA相對表達量：在細菌注射6h后，SP組KC mRNA的相對表達量相對于CON組明顯升高（13.48±1.056） vs（1±0.078），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P

12、<0.05）； SP+B7-H3組KC mRNA的相對表達量與SP組相比明顯升高（16.92±7.461）vs（13.48±1.056），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；24h時SP組KC mRNA相對表達量較CON組明顯升高（16.19±1.766） vs（1±0.236），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），SP+B7-H3組KC mRNA的相對表達量與SP組相比明顯升高（80.33±47.595）vs（16.19±1.766）

13、，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；在細菌注射后6h，SP組MIP-2 mRNA相對表達量較CON組升高（1.21±0.932）vs（1.01±0.008），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），SP+B7-H3組MIP-2 mRNA的相對表達量與SP組相比有升高（1.24±0.804）vs（1.21±0.932），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；24h時SP組MIP-2 mRNA相對表達量較CON組明顯升高（12.88±7.792）

14、vs（1.00±0.091），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），SP+B7-H3組 MIP-2 mRNA的相對表達量與 SP組相比明顯升高（38.76±6.061）vs（12.88±7.792），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）
　　5、腦組織免疫組化結(jié)果分析：三組腦膜炎小鼠腦組織胞膜和胞漿上均可見TLR2棕黃色陽性顆粒，6h、24hCON組TLR2有少量表達；SP組6h時表達開始上調(diào)（32.67±3.93）vs（1.00±0

15、.63），24h時表達明顯增多（59.83±12.12）vs（2.16±0.75），各時間點與CON組比較明顯增高（P<0.01）；SP+B7-H3干預(yù)組TLR2的表達較SP組進一步增高6h（50.5±8.73）vs（32.67±3.93）、24h（86.33±3.2）vs（59.83±12.12），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　二、體外實驗
　　1、SP組在細菌刺激后5h、24h、48h時，小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)上清中

16、趨化因子 KC的濃度明顯升高于CON組（219.19±139.87）vs（18.44±16.32），（P<0.05）；（2883.38±1957.20）vs（44.96±25.73），（P<0.05）；（4883.44±1062.75）vs（169.64±86.95） pg?ml-1，（P<0.05）;SP+B7-H3組在刺激后5h、24h、48h與SP組相比，KC的濃度均進一步顯著上升（1460.16±553.44）vs（219.19

17、±139.87），(P<0.05)；（6993.51±4869.28）vs（2883.38±1957.20），(P<0.05)；（10394.47±6012.32）vs（4883.44±1062.75） pg?ml-1，(P<0.05)。
　　2、SP組在刺激后5h、24h、48h時趨化因子MIP-2的表達明顯升高于CON組（324.60±2.29）vs（279.87±10.15），(P<0.05)；（340.00±23.38）v

18、s（287.78±9.89），(P<0.05)；（907.81±72.65）vs（288.66±13.50）pg?ml-1，(P<0.05);SP+B7-H3組在刺激后5h、24h、48h與SP組相比，MIP-2的表達均顯著上升（351.91±27.15）vs（324.60±2.29），(P<0.05)；（398.88±6.76）vs（340.00±23.38），(P<0.05)；（1483.75±211.50）vs（907.81±72

19、.65）pg?ml-1，(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、本實驗經(jīng)側(cè)腦室注射肺炎鏈球菌混懸液，成功建立了小鼠肺炎鏈球菌性腦膜炎模型。
　　2、體內(nèi)外實驗結(jié)果證實，趨化因子KC、MIP-2及TLR2蛋白在肺炎鏈球菌腦膜模型中表達量升高，趨化因子及 TLR2參與了腦膜炎病理損傷和免疫炎癥反應(yīng)過程。
　　3、協(xié)同信號分子 B7-H3加劇了細菌性腦膜炎病情的進展，促進腦組織免疫炎癥反應(yīng)，使趨化因子KC、MIP-2及