基于選擇性剔除的中藥有效成分辨識(shí)技術(shù)研究——?dú)w芎及紅花系列藥對(duì)的示范性研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代分析技術(shù)、分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)等的出現(xiàn)，為中藥效應(yīng)物質(zhì)的研究提供了很多技術(shù)與方法參考，但如何從整體角度出發(fā)，更準(zhǔn)確地反映中藥內(nèi)在的活性物質(zhì)還存在一定的難度，本研究在基因敲除和生物色譜技術(shù)的啟發(fā)下，意圖利用制備液相色譜技術(shù)對(duì)中藥中某些成分進(jìn)行剔除，并結(jié)合多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，從而進(jìn)行中藥效應(yīng)物質(zhì)的辨識(shí)，在闡明活性成分的同時(shí)進(jìn)一步判別活性成分的效應(yīng)貢獻(xiàn)。
　　本論文研究工作為國(guó)家科技支撐項(xiàng)目項(xiàng)目——

2、“中藥有效成分群關(guān)鍵技術(shù)研究”的部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。
　　論文共分為四章，第一章首先探討了對(duì)中藥藥效物質(zhì)的認(rèn)識(shí)，在此基礎(chǔ)上，系統(tǒng)地綜述了中藥藥效物質(zhì)傳統(tǒng)與現(xiàn)代研究思路與方法。第二章至第四章為實(shí)驗(yàn)部分，具體研究?jī)?nèi)容和相關(guān)結(jié)論如下:
　　第二章基于選擇性剔除比較阿魏酸在歸芎組對(duì)前后抗氧化活性的作用貢獻(xiàn)。以當(dāng)歸-川芎藥對(duì)及其組成藥味為研究對(duì)象，建立一種探索同一成分在不同中藥中效應(yīng)貢獻(xiàn)差異性的研究方法，進(jìn)而闡明中藥整體研究的重要性。采用制

3、備液相色譜分別剔除當(dāng)歸、川芎及歸芎藥對(duì)中的阿魏酸，然后對(duì)剔除阿魏酸前后溶液抗氧化活性進(jìn)行比較，進(jìn)而比較阿魏酸在藥對(duì)及其單味藥中的作用貢獻(xiàn)大小。
　　第一節(jié)歸芎藥對(duì)及其單昧藥中阿魏酸的剔除。采用制備液相色譜對(duì)當(dāng)歸-川芎藥對(duì)及其組成藥味中阿魏酸進(jìn)行選擇性剔除，并用分析型高效液相色譜對(duì)剔除前后溶液及剔除成分進(jìn)行分析。分析結(jié)果表明，三者中阿魏酸均被較好的剔除，且獲得了一定量的剔除阿魏酸后的樣品，以便用于后續(xù)活性評(píng)價(jià)。
　　第二節(jié)歸芎

4、藥對(duì)及其單味藥剔除阿魏酸前后體外抗氧化活性比較評(píng)價(jià)。采用DPPH自由基清除法，比較原方（剔除阿魏酸前）、剔除方（剔除阿魏酸后）以及還原方（在剔除方中加入一定量阿魏酸使其含量與原方中一致）抗氧化活性。結(jié)果顯示，剔除方加入與原方相同濃度的阿魏酸后，其抗氧化活性無(wú)顯著性差異，說(shuō)明從抗氧化活性上看，阿魏酸亦基本滿足剔除要求。比較原方與剔除方，結(jié)果顯示，原方剔除阿魏酸后，歸芎藥對(duì)及其單味藥抗氧化活性均有明顯下降，結(jié)果表明阿魏酸應(yīng)為歸芎藥對(duì)及其單味

5、藥抗氧化活性主要效應(yīng)物質(zhì)，其作用大小比較為:DG＞CX＞GX;而剔除方本身仍具有較強(qiáng)抗氧化活性，結(jié)果表明除阿魏酸外歸芎藥對(duì)抗氧化活性中還存在其他貢獻(xiàn)性成分。對(duì)阿魏酸在當(dāng)歸、川芎、歸芎藥對(duì)中的抗氧化活性的作用做進(jìn)一步比較，在剔除溶液的基礎(chǔ)上研究了不同濃度阿魏酸在歸芎藥對(duì)及其單味藥中的抗氧化活性。結(jié)果顯示，阿魏酸在歸芎藥對(duì)及其單味藥中抗氧化作用方面與劑量相關(guān)，在測(cè)定濃度下，它們的劑量效應(yīng)曲線作用趨勢(shì)一致，說(shuō)明阿魏酸在當(dāng)歸、川芎和歸芎中的抗氧

6、化活性方面起到重要作用，其作用大小比較:當(dāng)歸＞川芎≈歸芎藥對(duì)，這也進(jìn)一步證實(shí)了阿魏酸在當(dāng)歸中的作用比在川芎和歸芎中的作用要大。
　　本章研究將提供一種用于闡明相同成分在不同中藥中生物活性作用比較的有效方法，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)，也為制備液相研究中藥復(fù)雜成分引導(dǎo)了一個(gè)新的方向。
　　第三章基于選擇性剔除的紅花效應(yīng)物質(zhì)辨識(shí)與評(píng)價(jià)。以紅花為例，建立一種從整體角度研究中藥藥效物質(zhì)的方法。利用制備液相色譜選擇性剔除其主要成分，然后分別

7、對(duì)剔除前后的樣品進(jìn)行效應(yīng)評(píng)價(jià)，進(jìn)而比較分析得出紅花不同活性的主要效應(yīng)物質(zhì)及各成分的貢獻(xiàn)度。
　　第一節(jié)紅花中多種成分的剔除。采用制備液相色譜對(duì)紅花中主要成分進(jìn)行剔除，并用分析型高效液相色譜對(duì)剔除效果進(jìn)行隨行分析。結(jié)果共剔除13個(gè)成分，高效液相分析結(jié)果表明，剔除率均在85％以上，達(dá)到剔除要求，用該方法共獲得26個(gè)樣品，分別是分別剔除13個(gè)成分外的剔除后溶液（HH1-HH13），以及剔除的13個(gè)目標(biāo)成分(C1-C13)。采用HPLC-

8、Q-TOF-MS對(duì)剔除成分進(jìn)行分析，獲得相應(yīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)?；谧贤夂唾|(zhì)譜數(shù)據(jù)、對(duì)照品對(duì)照以及現(xiàn)有研究文獻(xiàn)對(duì)照，對(duì)剔除成分分別進(jìn)行結(jié)果鑒定，結(jié)果共鑒定了其中11個(gè)成分，分別為胞苷(1)、腺苷(2)、羥基紅花黃色素A(3)、6-羥基山柰酚-3，6-二氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷(5)、6-羥基山柰酚-3，6，7-三氧葡萄糖苷(6)、6-羥基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷(7)、6-羥基山柰酚-3，6-二氧葡萄糖苷和6-羥基山柰酚-3-

9、氧蕓香糖-6-氧葡萄糖苷的混合物(8)、脫水紅花黃色素B(9)、6-羥基山柰酚-3-氧蕓香糖苷(10)和山柰酚-3-氧蕓香糖苷(11)。剔除成分4、12和13由于數(shù)據(jù)不足未能鑒定。
　　第二節(jié)紅花體外藥理活性研究。為選擇合適的效應(yīng)評(píng)價(jià)指標(biāo)及合適的濃度用于后續(xù)活性比較研究，對(duì)紅花活血效應(yīng)（對(duì)家兔血小板聚集功能及凝血功能的影響）、抗氧化活性（DPPH自由基清除活性、ABTS自由基清除活性、Fe3+還原能力和羥自由基清除活性）、通經(jīng)相關(guān)

10、活性（對(duì)小鼠離體子宮收縮的影響、對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖的影響）等進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選擇0.59生藥/mL濃度下進(jìn)行抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集活性和APTT測(cè)定，選擇0.7g生藥/mL濃度下進(jìn)行PAF誘導(dǎo)的血小板聚集、TT和PT測(cè)定，選擇5 mg生藥/mL進(jìn)行紅花剔除成分及剔除前后溶液的DPPH清除率測(cè)定和FRAP法測(cè)定，選擇0.156mg生藥/mL濃度下進(jìn)行ABTS清除率測(cè)定，選擇以2×106濃度的細(xì)胞種板，200μg生藥/mL

11、終濃度下進(jìn)行大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)研究。羥自由基清除活性和對(duì)小鼠離體子宮收縮的影響相對(duì)較弱，故未作為后續(xù)活性研究指標(biāo)。
　　第三節(jié)紅花各成分剔除前后不同活性貢獻(xiàn)度比較評(píng)價(jià)。在上述研究基礎(chǔ)上，利用家兔血小板聚集活性、凝血功能、抗氧化活性和大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖活性等指標(biāo)比較評(píng)價(jià)紅花主要成分效應(yīng)貢獻(xiàn)。
　?。ㄒ唬?duì)家兔血小板聚集功能及凝血功能的影響。分別研究各樣品對(duì)ADP和PAF誘導(dǎo)的血小板聚集的影響以及對(duì)PT、APTT、TT的

12、延長(zhǎng)作用，并采用多指標(biāo)綜合指數(shù)法對(duì)活血化瘀效應(yīng)貢獻(xiàn)進(jìn)行整合。結(jié)果表明，成分5、6、8、10、12、13是紅花抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集活性主要物質(zhì)基礎(chǔ)，作用貢獻(xiàn)大小比較:13＞8＞10＞12＞6＞5;成分3、8、9、10、12、13是紅花抗PAF誘導(dǎo)的血小板聚集活性主要物質(zhì)基礎(chǔ)，作用貢獻(xiàn)大小比較:8＞13＞9＞12＞3＞10;成分2、7、8、9、11、12是紅花中影響外源性凝血系統(tǒng)中相關(guān)凝血因子（延長(zhǎng)PT）的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，作用貢獻(xiàn)大小比較

13、:3＞10＞11＞6＞4＞9;成分3、9、10是紅花中影響內(nèi)源性凝血系統(tǒng)中相關(guān)凝血因子（延長(zhǎng)APTT）的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，作用貢獻(xiàn)大小比較:10＞9＞3;成分1、3、4、6、10、11是紅花中影響凝血系統(tǒng)纖維蛋白原轉(zhuǎn)化（延長(zhǎng)TT）的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，作用貢獻(xiàn)大小比較:10＞11＞3＞4＞6＞1。通過(guò)多指標(biāo)綜合指數(shù)法獲得了各成分在紅花中的總活血效應(yīng)貢獻(xiàn)值，綜合考慮整合結(jié)果與不同指標(biāo)的主要活性成分，初步確定紅花活血效應(yīng)的主要活性成分為3（羥基紅花黃

14、色素A）、8（6-羥基山柰酚-3，6-二氧葡萄糖苷和6-羥基山柰酚-3-氧蕓香糖-6-氧葡萄糖苷的混合物）、9（脫水紅花黃色素B）、10（6-羥基山柰酚-3-氧蕓香糖苷），總活血效應(yīng)貢獻(xiàn)值大小順序依次為:10＞9＞3＞8。
　?。ǘw外抗氧化活性貢獻(xiàn)比較。采用三種抗氧化活性指標(biāo)（DPPH自由基清除活性、ABTS自由基清除活性和Fe3+還原能力測(cè)定）共同評(píng)價(jià)紅花中主要成分的作用及作用貢獻(xiàn)。結(jié)果顯示，成分1、3、4、5、8、9、10

15、、11、12、13是紅花清除DPPH自由基的主要活性成分，其貢獻(xiàn)比較:4＞1＞8＞10＞12＞11＞5＞9＞3＞13;成分1、3、5、8、10、11是清除ABTS自由基的主要活性成分，其貢獻(xiàn)比較:5＞3＞9＞10＞8＞1;紅花中各主要成分被剔除后，其對(duì)Fe3+的還原能力均有顯著降低，說(shuō)明這些主要成分對(duì)紅花Fe3+的還原能力方面均有一定作用，其貢獻(xiàn)比較:10＞8＞9＞12＞11＞7＞6＞1＞13＞4＞3＞2＞5。通過(guò)多指標(biāo)綜合指數(shù)法獲得了

16、各成分在紅花中的總抗氧化活性貢獻(xiàn)值，綜合考慮整合結(jié)果與不同指標(biāo)的主要活性成分，結(jié)果表明紅花抗氧化主要效應(yīng)物質(zhì)為1（胞苷）、4（未知）、8（6-羥基山柰酚-3，6-二氧葡萄糖苷和6-羥基山柰酚-3-氧蕓香糖-6-氧葡萄糖苷的混合物）、9（脫水紅花黃色素B）、10（6-羥基山柰酚-3-氧蕓香糖苷）、11（山柰酚-3-氧蕓香糖苷）、12（未知），總抗氧化效應(yīng)貢獻(xiàn)值大小順序依次為:10＞8＞4＞1＞9＞11＞12。
　　（三）對(duì)大鼠卵巢顆

17、粒細(xì)胞增殖的影響。利用大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)紅花中主要成分的作用及作用貢獻(xiàn)。結(jié)果顯示，成分除成分3和5外，其他成分對(duì)紅花促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖均有一定貢獻(xiàn)，其貢獻(xiàn)度大小比較:7＞6＞4＞11＞1＞8＞10＞9＞12＞13＞2。該部分研究一定程度上揭示了紅花通經(jīng)效應(yīng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，但目前指標(biāo)單一，還有待進(jìn)一步研究。
　　本章研究采用選擇性剔除技術(shù)與多指標(biāo)效應(yīng)綜合評(píng)價(jià)相結(jié)合，探索了一種較新穎而有效的研究中藥效應(yīng)物質(zhì)的方法，通

18、過(guò)這種方法，我們能從一定程度上闡明不同成分對(duì)中藥不同效應(yīng)表達(dá)直接或間接的貢獻(xiàn)以及貢獻(xiàn)度，同時(shí)也能從一定程度上闡明中藥的作用機(jī)制。
　　第四章基于選擇性剔除的紅花系列藥對(duì)中主要活血效應(yīng)物質(zhì)的剔除與效應(yīng)貢獻(xiàn)比較評(píng)價(jià)。以紅花及其系列藥對(duì)為例，建立一種從整體角度研究藥對(duì)效應(yīng)物質(zhì)作用變化的方法。利用制備液相色譜選擇性剔除其活血主要效應(yīng)物質(zhì)羥基紅花黃色素A(HSYA)和脫水紅花黃色素B(ASYB)，然后分別對(duì)剔除后的樣品進(jìn)行效應(yīng)評(píng)價(jià)，進(jìn)而比較

19、分析得出紅花不同配伍的主要效應(yīng)物質(zhì)貢獻(xiàn)度變化。
　　第一節(jié)紅花系列藥對(duì)中羥基紅花黃色素A和脫水紅花黃色素B的剔除。采用制備液相色譜對(duì)紅花系列藥對(duì)（紅花-桃仁、紅花-甘草、紅花-紅參、紅花-當(dāng)歸、紅花-蘇木、紅花-丹參、紅花-黃芪和紅花單味藥）中羥基紅花黃色素A和脫水紅花黃色素B這兩個(gè)成分分別進(jìn)行剔除，并用分析型高效液相色譜對(duì)剔除效果進(jìn)行隨行分析。結(jié)果表明，剔除率均在85％以上，達(dá)到剔除要求，用這種方法獲得了18個(gè)樣品，分別是HSY

20、A以及剔除HSYA后的樣品紅花(HH-1)、紅花-當(dāng)歸藥對(duì)(HD-1)、紅花-黃芪藥對(duì)(HQ-1)、紅花-丹參藥對(duì)(DH-1)、紅花-蘇木藥對(duì)(HM-1)、紅花-桃仁藥對(duì)(HT-1)、紅花-紅參藥對(duì)(HS-1)、紅花-甘草藥對(duì)(HG-1)，ASYB以及剔除ASYB后的樣品紅花(HH-2)、紅花-當(dāng)歸藥對(duì)(HD-2)、紅花-黃芪藥對(duì)(HQ-2)、紅花-丹參藥對(duì)(DH-2)、紅花-蘇木藥對(duì)(HM-2)、紅花-桃仁藥對(duì)(HT-2)、紅花-紅參

21、藥對(duì)(HS-2)、紅花-甘草藥對(duì)(HG-2)。
　　第二節(jié)紅花系列藥對(duì)主要活血效應(yīng)成分剔除前后活性評(píng)價(jià)。在上述研究基礎(chǔ)上，利用家兔血小板聚集活性、凝血功能等指標(biāo)比較評(píng)價(jià)紅花系列藥對(duì)主要活血效應(yīng)成分剔除前后貢獻(xiàn)度變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羥基紅花黃色素A和脫水紅花黃色素B對(duì)紅花及其系列藥對(duì)活血效應(yīng)均有一定貢獻(xiàn)，HSYA在紅花及其系列藥對(duì)中的貢獻(xiàn)度大小比較:HS＞HM＞HD＞HQ＞HT＞HG＞DH＞HH，ASYB在紅花及其系列藥對(duì)中的貢獻(xiàn)度大小

22、比較:HG＞HT＞HD＞HM＞DH＞HQ＞HS＞HH。這兩個(gè)成分在紅花及其系列藥對(duì)中作用基本一致，但在不同配伍條件下作用大小有較大差異，且在不同效應(yīng)指標(biāo)中的作用貢獻(xiàn)也不盡相同。
　　本章研究采用制備液相剔除技術(shù)與多指標(biāo)效應(yīng)綜合評(píng)價(jià)相結(jié)合，探索了一種較新穎而有效的研究藥對(duì)效應(yīng)物質(zhì)變化的方法，可以從一定程度上闡明了藥對(duì)配伍的變化，將有助于更好進(jìn)行中藥藥對(duì)的研究。
　　結(jié)論:本論文通過(guò)對(duì)歸芎組對(duì)前后阿魏酸作用貢獻(xiàn)比較以及紅花及其系