腸桿菌MFS外排泵耐藥基因的分布及多態(tài)性研究.pdf

1、目的：
　　 MFS類外排泵不但是臨床重要細菌（尤其是非發(fā)酵菌）耐藥性形成的重要因素，而且常常通過可移動因子在不同種屬菌株間進行水平轉(zhuǎn)移，形成耐藥性播散，因此，開展MFS類外排泵的多樣性和多態(tài)性及其在不同種屬菌株的分布、外排泵耐藥基因結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、演變規(guī)律和分子進化的研究具有特別重要的意義。本文研究結(jié)果對于指導臨床合理用藥、病原菌耐藥性基因診斷試劑盒及新型抗生素的研發(fā)以及防止耐藥性播散，都具有重要的參考價值。
　　 方

2、法：
　　 1.本課題從溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院臨床得到革蘭氏陰性菌作為本實驗菌株來源，共六個樣本，其中鮑曼不動桿菌238株，肺炎克雷伯菌240株，大腸埃希菌200株，銅綠假單胞菌239株，沙門氏菌201株，陰溝腸桿菌238株。每株細菌經(jīng)單獨培養(yǎng)后，同種細菌混合后采用SDS法提取混合細菌基因組DNA，將基因組DNA送交中科院北京基因組研究所進行solexa測序。
　　 2.將六個樣本測序所得到的短序列通過一系列的生物信息學

3、工具，與從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫和ARDB中收集到的MFS外排泵耐藥基因參考序列進行比對分析，找出樣本里所包含的MFS外排泵耐藥基因類型及豐度的差異。同時為進一步實驗驗證這一方法的正確性提供參考。
　　 3.選取其中的floR基因為代表，設(shè)計特異性引物，PCR擴增并克隆測序，分析基因floR的多態(tài)性;取不同基因型克隆進行MIC實驗，驗證基因的結(jié)構(gòu)與耐藥性功能的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.鮑曼不動桿菌中

4、的測序結(jié)果產(chǎn)生solexa reads總數(shù)為377，056，430，其中可以定位到收集到的MFS耐藥基因參照序列上的reads約占0.21％。肺炎克雷伯菌中的測序結(jié)果產(chǎn)生solexa reads總數(shù)為182，032，468，可以定位到收集到的MFS參照序列上的reads約占0.52％。大腸埃希菌中的測序結(jié)果產(chǎn)生solexa reads總數(shù)為200，565，354，其中可以定位到收集到的MFS耐藥基因參照序列上的reads約占0.61％。

5、銅綠假單胞菌中的測序結(jié)果產(chǎn)生solexa reads總數(shù)為140，478，390，其中可以定位到收集到的MFS耐藥基因參照序列上的reads約占0.20％。沙門氏菌中的測序結(jié)果產(chǎn)生solexa reads總數(shù)為132，858，534，其中可以定位到收集到的MFS耐藥基因參照序列上的reads約占0.51％。陰溝腸桿菌中的測序結(jié)果產(chǎn)生solexa reads總數(shù)為294，298，898，其中可以定位到收集到的MFS耐藥基因參照序列上的re

6、ads約占0.50％。
　　 2.六個樣本的腸桿菌基因組中含有數(shù)量可觀的MFS外排泵耐藥基因，包括氯霉素類、四環(huán)素類、林可霉素類、諾氟沙星類、甲基紫類、阿拉伯糖類、多耐藥類等共計17種MFS外排泵耐藥基因型及11種轉(zhuǎn)運蛋白。
　　 3.floR, cmlA， tetA, emrB, emrD, emrK,emrY,yieO,yebQ這9個基因型是六個臨床細菌樣本中最為流行的MFS外排泵耐藥基因型。
　　 4.將六

7、個樣本中floR基因的克隆測序結(jié)果經(jīng)信息處理提取ORF后共發(fā)現(xiàn)339個位點存在多態(tài)現(xiàn)象，聚類分析所有floR基因可分為Cluster1和Cluster2，兩者序列同源性在81％左右，其中Cluster1中161個，Cluster2中15個。另外還有三條序列與這兩類均有一定的相關(guān)性，但不能明確歸類。
　　 5.SNPs位點分析中，Cluster1發(fā)現(xiàn)53個同義突變(Ks)，103個非同義突變(Ka)，5個無義突變。Cluster2

8、中5個同義突變，10個非同義突變。
　　 6.選取97個不同基因型克隆進行藥物敏感性測定，結(jié)果顯示絕大多數(shù)攜帶floR基因的克隆菌株對氯霉素的MIC值范圍為8-512ug/ml，60％以上菌株的MIC值大于或等于256ug/ml，而對照株P(guān)UC18的MIC值只有16ug/ml。結(jié)果說明不同結(jié)構(gòu)floR基因?qū)β让顾氐耐馀拍芰τ忻黠@的不同。
　　 結(jié)論：
　　 1.從方法學角度來說，新一代高通量測序技術(shù)非常適合用來分