腸桿菌科細菌外排泵TolC功能研究.pdf

1、[目的]：
　　1.對五種腸桿菌科細菌（埃希菌屬、志賀菌屬、沙門菌屬、腸桿菌屬與克雷伯菌屬）TolC基因序列及蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)進行比對，比較屬間相似性。
　　2.以大腸埃希菌TolC晶體結(jié)構(gòu)為模板，對其余四個屬細菌的TolC進行同源建模，并分析其空間構(gòu)象及參與外排泵裝配相關(guān)氨基酸位點的異同。
　　3.敲除大腸埃希菌E.coli DH5α的TolC基因;構(gòu)建五種腸桿菌科細菌TolC的組成性表達載體，并轉(zhuǎn)化E.coli DH

2、5α，使不同TolC基因在E.coli DH5α中表達，形成雜合AcrAB-TolC外排泵。通過比較攜帶不同TolC基因的E.coli DH5α對典型TolC底物的MIC，間接反應雜合型AcrAB-TolC外排泵是否能夠成功裝配并形成具有功能的多耐藥外排泵。
　　[方法]：
　　1.TolC基因序列的比對:根據(jù)文獻報道，通過ClustalW2預測五種臨床常見腸桿菌科細菌TolC的同源性，比較屬間相似性。
　　2.同源建

3、模及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較:由于目前尚無其他腸桿菌科細菌TolC晶體結(jié)構(gòu)的報道，于是，我們采用Swiss-Model在線同源建模軟件，以大腸埃希菌的TolC晶體結(jié)構(gòu)作為模板，構(gòu)建其他四種細菌TolC的晶體結(jié)構(gòu);然后采用VMD軟件分析五種細菌的TolC的三維結(jié)構(gòu)及外排泵裝配關(guān)鍵氨基酸位點，預測其他四種TolC與大腸埃希菌AcrB、AcrA裝配的的可能性。
　　3.E.coli DH5α TolC的敲除:采用Red同源重組系統(tǒng)（質(zhì)粒pKD46

4、），將擬敲除的TolC基因替換為一段兩端含有FRT位點的卡那霉素抗性基因。再通過pCP20質(zhì)粒表達的Flp重組酶，作用于FRT位點，消除抗性基因，從而完全敲除菌株體內(nèi)TolC基因。
　　4.TolC表達載體的構(gòu)建:采用HindⅢ與BspHI核酸內(nèi)切酶切除質(zhì)粒pTrc99A帶有的氨芐青霉素抗性啟動子及其開放閱讀框（open read frame，ORF），將五種TolC ORF插入到HindⅢ與BspHI酶切位點，使TolC基因的表

5、達位于啟動子 Ptrc調(diào)控下，獲得TolC組成性表達載體。
　　5.最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）的測定:用微量肉湯稀釋法檢測MIC。挑選具有代表性的抗生素，將培養(yǎng)物與抗生素在96孔板中混勻，于37℃普通空氣孵箱中孵育16～20h后判斷結(jié)果。以在小孔內(nèi)完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。
　　[結(jié)果]：
　　1.TolC基因序列的比對:我們通過Clustal

6、 W2提供的在線序列比對，對這五種腸桿菌科細菌多重耐藥外排泵AcrAB-TolC的TolC進行序列比對分析，比對了多種臨床常見腸桿菌科細菌TolC的同源性（埃希菌屬、志賀菌屬、沙門菌屬、腸桿菌屬與克雷伯菌屬），結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌與其他四個屬細菌TolC的核酸序列屬間同源性分別達到98％、82％、80％與78％，氨基酸序列屬間同源性分別達到99％、89％、84％與83％;除此之外，TolC與AcrB作用的關(guān)鍵位點氨基酸及其周圍序列完全一致

7、。另外，通過對其他四個屬細菌之間相互比較，發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列的同源性也都在80％以上。
　　2.同源建模及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析:我們進一步采用Swiss Model軟件，以大腸埃希菌TolC的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)(PDB:1EK9)作為模板進行同源建模技術(shù)，獲得了其他四種細菌TolC的三維結(jié)構(gòu)。通過對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行比較發(fā)現(xiàn)，這五種細菌的TolC出口端的形狀、各維度的尺寸等空間構(gòu)象參數(shù)相似性極高，且參與外排泵組裝的關(guān)鍵氨基酸所處的位置也極為相似。

8、
　　3.敲除E.coli DH5α的TolC:抗生素抗性及PCR檢測結(jié)果表明，E.coli DH5α的TolC基因被成功敲除。
　　4.構(gòu)建雜合AcrAB-TolC外排泵:成功構(gòu)建TolC的組成性表達載體，通過檢測MIC發(fā)現(xiàn)，志賀菌屬、沙門菌屬、腸桿菌屬與克雷伯菌屬的TolC均能與大腸埃希菌的AcrB-AcrA裝配成具有功能的雜合型外排泵。
　　5.MIC檢測結(jié)果:挑選五種具有代表性的物質(zhì)，脫氧膽酸鈉、氯霉素、四環(huán)素

9、、SDS、氨芐青霉素，采用微量肉湯稀釋法檢測MIC。結(jié)果發(fā)現(xiàn):雜合型AcrAB-TolC與野生型AcrAB-TolC相比:①雜合型AcrAB-TolC的外排泵對五種物質(zhì)依舊耐藥;②敲除TolC基因的大腸埃希菌的MIC明顯降低;③沒有出現(xiàn)雜合型AcrAB-TolC MIC升高;④雜合型AcrAB-TolC與野生型AcrAB-TolC相比的MIC略有下降，但不具有顯著差異。
　　[結(jié)論]：
　　1.腸桿菌科細菌的TolC在基因與

10、氨基酸序列上具有較高的相似性，其空間構(gòu)象也極為相似，而且在與大腸埃希菌AcrB相互作用的氨基酸位點上也極為相似。
　　2.采用Red同源重組技術(shù)成功敲除E.coli DH5α的TolC基因，并成功構(gòu)建不同腸桿菌科細菌TolC基因的組成性表達載體。
　　3.通過檢測MIC值發(fā)現(xiàn)志賀氏菌、沙門氏菌、陰溝腸桿菌與肺炎克雷伯菌的TolC能與大腸埃希菌的AcrA-AcrB形成具有活性的雜合外排泵，表明腸桿菌科細菌的TolC基因可在上述