陰溝腸桿菌中若干β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因的篩選及功能研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)高通量測(cè)序以及生物信息學(xué)的方法鑒定陰溝腸桿菌基因組數(shù)據(jù)中β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因的分布情況。篩選出所選耐藥基因并研究其耐藥性，接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)探討基因定位，推測(cè)其傳播機(jī)制。
　　方法：
　　1、本課題以2009年到2011年從溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離得到的238株革蘭氏陰性桿菌菌陰溝腸桿菌作為本實(shí)驗(yàn)的測(cè)序菌株。每株細(xì)菌經(jīng)過(guò)單獨(dú)培養(yǎng)，混合后采用SDS法提取混合細(xì)菌基因組DNA，送到中科院北京基因組研究所進(jìn)

2、行solexa測(cè)序。
　　2、通過(guò)利用生物信息學(xué)工具，將測(cè)序數(shù)據(jù)與從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中收集的β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，找出測(cè)序數(shù)據(jù)中包含的β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因的類(lèi)型以及豐度的差異。為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)做出預(yù)測(cè)及理論上的依據(jù)。
　　3、選取鑒定到的β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因中報(bào)道較少的blaVEB，blaZ，blaMIR，blaKLUC，blaAZECL-29為代表，設(shè)計(jì)特異性引物，以2008年到2012年從溫州醫(yī)

3、科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床得到的212株陰溝腸桿菌基因組DNA為模板，PCR反應(yīng)篩選出含有目的基因的菌株，并對(duì)目的基因進(jìn)行測(cè)序，確定其基因型。
　　4、將全部目的基因分別連接至表達(dá)載體pET-28a上，再轉(zhuǎn)化到工程菌大腸桿菌BL21中，然后通過(guò)瓊脂稀釋法來(lái)測(cè)定陽(yáng)性克隆株對(duì)多種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)，通過(guò)與陰性對(duì)照菌的MIC值比較來(lái)判斷其耐藥功能。
　　5、通過(guò)接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)來(lái)探究耐藥基因是否編碼于可接合轉(zhuǎn)移質(zhì)

4、粒，并推測(cè)其傳播機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、陰溝腸桿菌基因組經(jīng)測(cè)序產(chǎn)生294，298，898對(duì)solexa reads，利用生物信息學(xué)技術(shù)我們?cè)陉帨夏c桿菌的基因組數(shù)據(jù)當(dāng)中共鑒定到14種β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因，它們分別是blaVEB，blaZ，blaDHA，blaSHV，blaiR，blaTEM，blaOXA，blaCTX-M-9，blaSFO,ampH,blaCTX-M-1,blaKLUC,blaACT,blaAZECL-29

5、。
　　2、選取相對(duì)稀有β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因blaVEB，blaZ，blaMIR，blaKLUC，blaAZECL-29設(shè)計(jì)特異性引物，以陰溝桿菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增反應(yīng)篩選出1株陰溝腸桿菌基因組攜帶blaVEB基因，2株攜帶blaZ基因，6株攜帶blaMIR基因，2株攜帶blaAZECL-29基因，其中blaVEB基因與數(shù)據(jù)庫(kù)中的blaVEB-3基因亞型相似性為100％，blaMIR及blaAZECL-29與數(shù)據(jù)庫(kù)中最

6、為接近的基因型都具有99％以上的相似性。
　　3、耐藥基因blaVEB(Y412)對(duì)氨芐西林、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢噻利、頭孢唑林等藥物表現(xiàn)出了顯著耐藥性的提升，耐藥濃度分別提升了7、8、7、4、3個(gè)梯度，耐藥基因blaZ(CG3)、blaZ(CG4)只表現(xiàn)出對(duì)氨芐西林的耐藥性的提升，耐藥濃度提升了3個(gè)梯度。不同亞型的blaMIR基因耐藥功能基本一致，同時(shí)表現(xiàn)出了對(duì)氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢米諾、頭孢唑林、頭孢

7、西丁、頭孢曲松、氨曲南、哌拉西林、派拉西林他唑巴坦的耐藥性的提升，耐藥濃度分別提升了8、6、8、6、5、7、4、9、6、4、4個(gè)梯度。兩種亞型的耐藥基因blaAZECL-29(Y411)、blaAZECL-29(CG90)的耐藥性基本相同，同時(shí)表現(xiàn)出了氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢米諾、頭孢唑林、頭孢西丁、頭孢曲松、哌拉西林、派拉西林他唑巴坦的耐藥性的提升，耐藥濃度分別提高了6、5、4、4、7、3、8、4、3個(gè)梯度。
　　4、

8、接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)得1株成功接合子Y412/EC600，提取供體菌及接合子質(zhì)粒質(zhì)粒，電泳結(jié)果表明供體菌Y412中大小約為20-50kb的質(zhì)粒經(jīng)細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移進(jìn)入了受體菌EC600。結(jié)合PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)表明blaVEB未位于接合子質(zhì)粒中，其余陽(yáng)性細(xì)菌皆為接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)陰性，藥物敏感實(shí)驗(yàn)中接合子表現(xiàn)出了對(duì)氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢噻利、頭孢唑林、頭孢曲松、氨曲南、哌拉西林、哌拉西林他唑巴坦、亞胺培南西司他丁等多種β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素顯著的

9、耐藥性的提升，耐藥濃度分別提高了10、6、7、8、8、8、11、12、6、6、4個(gè)梯度。
　　結(jié)論：
　　1、方法學(xué)上表明，高通量測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)方法的結(jié)合，可以使我們?cè)诙虝r(shí)間內(nèi)獲得上百株細(xì)菌的基因組序列，探索基因組序列結(jié)構(gòu)與病原微生物的耐藥性關(guān)系，對(duì)于致病菌中耐藥基因的分布和新基因的發(fā)掘及功能研究起著及其有效的作用;生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)分析對(duì)實(shí)驗(yàn)操作具有強(qiáng)烈的指導(dǎo)作用，然而信息學(xué)的結(jié)論同時(shí)也需要對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)驗(yàn)證。

10、>　　2、從溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院分離的陰溝腸桿菌中預(yù)測(cè)并成功篩選得到1株攜帶blaVEB基因、2株攜帶blaZ基因、6株攜帶blaMIR基因、2株攜帶blaAZECL-29基因。
　　3、耐藥基因blaVEB對(duì)半合成廣譜青霉素氨芐西林、一代頭孢頭孢唑林、三代頭孢頭孢他啶、頭孢哌酮、四代頭孢頭孢噻利等藥物表現(xiàn)出了顯著耐藥性的提升，耐藥濃度分別提升了7、3、8、7、4個(gè)梯度，由此可見(jiàn)β內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因blaVEB具有多種β內(nèi)酰胺類(lèi)

11、抗生素的耐藥性。其中對(duì)半合成廣譜青霉素氨芐西林、三代頭孢頭孢他啶、頭孢哌酮耐藥性的提高尤為明顯，耐藥梯度分別提高了7、8、7個(gè)梯度。耐藥基因blaZ只表現(xiàn)出對(duì)半合成廣譜青霉素氨芐西林的耐藥性的提升，耐藥濃度提升了3個(gè)梯度。不同亞型的blaiR基因耐藥功能基本一致，同時(shí)表現(xiàn)出了對(duì)半合成廣譜青霉素氨芐西林、哌拉西林、半合成的廣譜青霉素/β內(nèi)酰胺酶抑制劑派拉西林他唑巴坦、頭霉素類(lèi)頭孢米諾、頭孢西丁、單環(huán)類(lèi)氨曲南、一代頭孢頭孢唑林、三代頭孢頭孢

12、他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢曲松的耐藥性的提升，耐藥濃度分別提升了8、4、4、5、4、6、7、6、8、6、9個(gè)梯度。由此可見(jiàn)β內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因blaiR具有廣泛的β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的耐藥性。其中對(duì)半合成廣譜青霉素氨芐西林及頭孢類(lèi)抗生素一代頭孢頭孢唑林、三代頭孢頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢曲松的耐藥性提升尤為明顯，耐藥濃度分別提升了8、7、6、8、6、9個(gè)梯度。兩種亞型的耐藥基因blaAZECL-29的耐藥性基本相同，同時(shí)表現(xiàn)出了半

13、合成廣譜青霉素氨芐西林、哌拉西林、半合成的廣譜青霉素/β內(nèi)酰胺酶抑制劑派拉西林他唑巴坦、頭霉素類(lèi)頭孢米諾、頭孢西丁、一代頭孢頭孢唑林、三代頭孢頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢曲松的耐藥性的提升，耐藥濃度分別提高了6、4、3、4、3、7、5、4、8個(gè)梯度。由此可見(jiàn)β內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因blaAZECL-29具有廣泛的β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的耐藥性。其中對(duì)三代頭孢頭孢曲松的耐藥性提升尤為明顯，耐藥濃度提高了8個(gè)梯度。
　　將不同基因耐藥濃度的提升情況進(jìn)

14、行對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，其中blaMIR基因與blaAZECL-29基因耐藥濃度提升情況非常相似，除了blaMIR基因單獨(dú)表現(xiàn)出的頭孢他定和氨曲南耐藥濃度的提升之外，兩基因均表現(xiàn)出了對(duì)半合成廣譜青霉素氨芐西林、哌拉西林、半合成的廣譜青霉素/β內(nèi)酰胺酶抑制劑派拉西林他唑巴坦、頭霉素類(lèi)頭孢米諾、頭孢西丁、一代頭孢頭孢唑林、三代頭孢頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢曲松耐藥濃度的提升，耐藥濃度提升的梯度也較為相似，且blaiR基因耐藥濃度提升的梯度均略大于或等

15、于blaAZECL-29基因耐藥濃度提升的梯度。
　　blaMIR及blaAZECL-29基因編碼的氨基酸序列長(zhǎng)度相等，且具有95％(361/381)的相似性，對(duì)比耐藥濃度提升梯度分析結(jié)果可知，兩條氨基酸序列中不同的位點(diǎn)，都可能是blaMIR基因表現(xiàn)出頭孢他啶和氨曲南耐藥性的關(guān)鍵位點(diǎn)。而這些位點(diǎn)的改變也使得blaMIR基因?qū)ζ渌聝?nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生了一定的影響。
　　4、接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)得1株成功接合子Y412/EC6