AcrAB-TOIC主動(dòng)外排系統(tǒng)在陰溝腸桿菌多重耐藥中的作用.pdf

1、目的：
　　 了解粵西地區(qū)臨床分離陰溝腸桿菌的耐藥現(xiàn)狀和耐藥水平；測定外排泵抑制劑對陰溝腸桿菌耐藥表型的影響，初步探討陰溝腸桿菌中主動(dòng)外排系統(tǒng)的分布情況；明確AcrAB-TOIC主動(dòng)外排系統(tǒng)在陰溝腸桿菌中的分布情況，闡明主動(dòng)外排系統(tǒng)與陰溝腸桿菌耐藥性的關(guān)系；闡明AcrAB-TOIC主動(dòng)外排系統(tǒng)基因acrA基因mRNA表達(dá)水平與陰溝腸桿菌耐藥性的相關(guān)性，為明確本地區(qū)陰溝腸桿菌多重耐藥機(jī)制及合理使用抗生素提供參考依據(jù)。
　　

2、 方法：
　　 1.采用VITEK32系統(tǒng)鑒定陰溝腸桿菌，并對其標(biāo)本來源及臨床科室分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 2.測定陰溝腸桿菌對抗生素的敏感性：
　　 (1)采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)測定83株陰溝腸桿菌對20種臨床常用抗菌藥物的敏感性；
　　 (2)采用瓊脂稀釋法測定83株陰溝腸桿菌對5種抗生素的最小抑菌濃度。
　　 3.采用瓊脂稀釋法測定外排泵抑制劑CCCP對陰溝腸桿菌耐藥表型的影響，篩選出外

3、排陽性菌株，初步探討臨床分離陰溝腸桿菌中主動(dòng)外排系統(tǒng)的分布情況。
　　 4.提取陰溝腸桿菌基因組DNA并設(shè)計(jì)序列特異性引物，PCR擴(kuò)增acrA和acrB基因并做測序分析，了解外排泵基因分布情況；分析外排泵基因陽性株之間及與陰性株之間的耐藥表型差異，以闡明主動(dòng)外排系統(tǒng)在陰溝腸桿菌多重耐藥中的作用。
　　 5.提取陰溝腸桿菌總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法，以16S rRNA表達(dá)水平為內(nèi)參，檢測acrA基因mRNA表

4、達(dá)水平，闡明AcrAB-TOIC主動(dòng)外排系統(tǒng)基因表達(dá)水平與陰溝腸桿菌耐藥性的相關(guān)性，以進(jìn)一步明確主動(dòng)外排系統(tǒng)在陰溝腸桿菌多重耐藥中的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.共分離出83株陰溝腸桿菌，各類標(biāo)本以痰液為首位，為40例占48.2％，其次為尿液，為17例占20.5％，其余分別來源于分泌物(10.8％)、膿液(7.2％)、引流液(7.2％)和血液(6.1％)等；標(biāo)本分離于臨床多個(gè)科室，其中以ICU為最高，為18例占21.7

5、％，其次為泌尿外科、呼吸內(nèi)科、兒科和肝膽外科等科室。
　　 2.陰溝腸桿菌對20種臨床常用抗生素的藥敏結(jié)果顯示：菌株均表現(xiàn)出較高耐藥率，其中對氨芐西林的耐藥率最高，達(dá)96.4％；對頭孢菌素類抗生素的耐藥率也普遍較高，特別是對頭孢唑啉的耐藥率，達(dá)90.4％；菌株對喹諾酮類的耐藥相對較低，在60.0％～70.0％之間，所有菌株對亞胺培南100％敏感。瓊脂稀釋法結(jié)果顯示83株陰溝腸桿菌對5種抗生素的耐藥率均大于60％，本法共篩選出多重

6、耐藥株70株。采用秩和檢驗(yàn)分析兩種方法的藥物敏感性測定結(jié)果，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.以頭孢他啶、阿米卡星、阿奇霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素為底物，分別有30、36、19、32、28株陰溝腸桿菌在10μg/ml CCCP條件下MIC值降低4倍或4倍以上即外排表型陽性，其中有19株同時(shí)對3種及3種以上抗生素有外排作用。加入CCCP后，對5種藥物的耐藥率均呈不同程度下降，下降率分別為15.7％、10.9％、6.0％、10.8％、10.

7、9％。采用t檢驗(yàn)比較，CCCP應(yīng)用后，5種抗生素MIC值變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，阿米卡星MIC值受影響最大，降低了5倍。應(yīng)用泵抑制劑CCCP共篩選出68株外排泵陽性株。將其分為泵陰性組和陽性組，對頭孢他啶、阿米卡星、阿奇霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素5種藥物耐藥率，泵陽性組均高于陰性組。
　　 4.83株陰溝腸桿菌中，55株菌同時(shí)檢出acrA基因和acrB基因，檢出率為66.27％；兩種基因均未檢出的菌株有28株，占總數(shù)的33.73％。測

8、序結(jié)果與Genbank上的相應(yīng)基因信息進(jìn)行Blast比對分析，所測acrA基因序列與登錄號為DQ679966陰溝腸桿菌同源性為95％，acrB基因序列與登錄號為AM287287陰溝腸桿菌同源性為100％。
　　 5.83株分別耐1種、2種、3種、4種和5種抗生素陰溝腸桿菌的acrA基因mRNA表達(dá)水平相對均值分別為0.72±0.117、0.851±0.123、1.797±0.365、2.028±0.425、2.150±0.275

9、，可見隨著菌株耐藥程度增加，外排泵基因的表達(dá)水平也相應(yīng)升高。采用成組設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，結(jié)果如下：耐5種抗生素陰溝腸桿菌acrA基因mRNA表達(dá)水平顯著高于耐1種、2種和3種抗生素菌株(p<0.01)；耐3種和4種抗生素菌株acrA基因mRNA表達(dá)水平高于耐1種和2種抗生素菌株(p<0.01)；耐4種和5種抗生素耐藥株之間及耐1種和2種抗生素耐藥株之間acrA基因mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　

10、 結(jié)論：
　　 1.陰溝腸桿菌引起的感染以呼吸道為主；
　　 2.抗生素敏感試驗(yàn)結(jié)果顯示：粵西地區(qū)陰溝腸桿菌的耐藥現(xiàn)狀較嚴(yán)重，且多重耐藥株分布廣泛；
　　 3.泵抑制劑CCCP可以降低陰溝腸桿菌的耐藥程度或提高其敏感性，但對不同抗生素的逆轉(zhuǎn)程度不同；
　　 4.應(yīng)用CCCP進(jìn)行外排泵陽性篩選結(jié)果可靠，但其特異性不高；
　　 5.主動(dòng)外排系統(tǒng)在臨床分離陰溝腸桿菌中廣泛分布，不僅存在于耐藥株中，而且存