六價(jià)鉻對(duì)大鼠肝細(xì)胞線粒體呼吸鏈電子漏的影響研究.pdf

1、目的：
　　 確定適用于線粒體功能活性試驗(yàn)研究的線粒體提取方法,并初步探索Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞線粒體呼吸鏈電子漏增加的機(jī)制,為闡明Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化損傷的機(jī)制提供線索。
　　 方法：
　　 分別用蔗糖法和試劑盒法提取大鼠肝細(xì)胞線粒體,用OPTEC光學(xué)顯微鏡和H-600透射電子顯微鏡觀察線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)。用960MC熒光分光光度計(jì)和Clark氧電極測(cè)定線粒體提取0.5h、1.5h和2.5h后的線粒

2、體膜電位,ST3,ST4及呼吸控制率。用SP-756P可見分光光度計(jì)測(cè)定線粒體及其他亞細(xì)胞器特異性標(biāo)志酶的酶比活性。分別以谷氨酸/蘋果酸和琥珀酸為呼吸底物,啟動(dòng)線粒體主呼吸鏈和次呼吸鏈的電子傳遞。測(cè)定不同濃度的Cr(Ⅵ)對(duì)肝細(xì)胞線粒體呼吸鏈ROS生成量的影響。用Clark氧電極測(cè)定肝細(xì)胞線粒體主呼吸鏈和次呼吸鏈的基礎(chǔ)呼吸速率。線粒體懸液用Cr(Ⅵ),GSH和各種復(fù)合體抑制劑處理。其中,線粒體主呼吸鏈電子傳遞用Rot,DPI和Ant單獨(dú)或

3、聯(lián)合處理,而線粒體次呼吸鏈電子傳遞用Rot,DPI,TTFA和Ant單獨(dú)或聯(lián)合處理。用VarioskanFlash4.00.52多功能酶標(biāo)儀分別測(cè)定各組線粒體主呼吸鏈和次呼吸鏈O2·-和ROS的生成量。
　　 結(jié)果：
　　 1.蔗糖法提取的線粒體膜電位和呼吸控制率顯著高于試劑盒法,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。兩種方法提取的線粒體標(biāo)志酶的純化倍數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。兩種方法提取的線粒體超微結(jié)構(gòu)均完整,未見

4、腫脹或損傷,但試劑盒法提取的線粒體純度較差,可見大量泡狀體。
　　 2.Cr(Ⅵ)在0-100μM的濃度范圍內(nèi),能誘導(dǎo)肝細(xì)胞線粒體主呼吸鏈和次呼吸鏈ROS的生成量隨著Cr(Ⅵ)濃度的增加而增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。線粒體次呼吸鏈的基礎(chǔ)呼吸速率大于主呼吸鏈的基礎(chǔ)呼吸速率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.以谷氨酸/蘋果酸為呼吸底物時(shí),與對(duì)照組相比,Rot組,Rot+Ant組和DPI+Ant組的RO

5、S含量和電子漏增加,Rot+DPI組和Ant組ROS含量增加,DPI組的ROS含量降低(P＜0.05)。與Cr(Ⅵ)組相比,Cr(Ⅵ)+Rot組,Cr(Ⅵ)+Am組,Cr(Ⅵ)+Rot+DPI組,Cr(Ⅵ)+Rot+Ant組和Cr(Ⅵ)+DPI+Ant組的ROS含量和電子漏增加,Cr(Ⅵ)+DPI組ROS含量增加(P＜0.05)。
　　 4.以琥珀酸為呼吸底物時(shí),與對(duì)照組相比,Rot組,DPI組,Rot+DPI組,Rot+TTF

6、A組和DPI+TTFA組ROS含量和電子漏降低,TTFA組,Ant組,Rot+Ant組,Rot+DPI組和TTFA+Ant組的RQS含量和電子漏增加,Rot+TTFA組的ROS含量降低(P＜0.05)。與Cr(Ⅵ)組相比,Cr(Ⅵ)+Rot組,Cr(Ⅵ)+DPI組和Cr(Ⅵ)+Rot+DPI組的ROS含量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。Cr(Ⅵ)+TTFA組和Cr(Ⅵ)+Rot+TTFA組,Cr(Ⅵ)+Ant組,Cr(Ⅵ)+Rot+An

7、t組,Cr(Ⅵ)+DPI+Ant組和Cr(Ⅵ)+TTFA+Ant組ROS生成量和電子漏增加,Cr(Ⅵ)+DPI+TTFA組減少(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.蔗糖法提取的線粒體,與試劑盒法相比,線粒體膜功能和呼吸功能良好,純度高,超微結(jié)構(gòu)完整,能滿足后續(xù)線粒體功能活性研究的需要。
　　 2.50uM Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)肝細(xì)胞線粒體主呼吸鏈電子漏增加,主要從復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅲ的泛醌結(jié)合位點(diǎn)漏出。對(duì)于次呼吸鏈