IL-33在β-淀粉樣蛋白刺激視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的表達(dá)及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.本課題以IL-33作為主要研究對(duì)象，研究其在β-淀粉樣蛋白（Aβ）刺激人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的表達(dá)特性。
　　2.初步探明IL-33在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的作用及機(jī)制。
　　方法：
　　1.IL-33在β-淀粉樣蛋白刺激人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的表達(dá)特性研究
　　采用MTT法檢測(cè)不同濃度Aβ1-40刺激D407細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存活率，觀察其對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷的影響。提取不同濃度A

2、β1-40刺激D407細(xì)胞24h后細(xì)胞RNA，采用定量PCR檢測(cè)IL-33mRNA水平；收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA檢測(cè)IL-33蛋白表達(dá)；加入NF-κB，ERK1/2，JNK，p38MAPK信號(hào)通路抑制劑后，采用定量PCR及ELISA檢測(cè)0.3μMAβ1-40刺激D407細(xì)胞24h后IL-33mRNA及蛋白水平表達(dá)，鑒定β-淀粉樣蛋白刺激視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞后調(diào)控產(chǎn)生IL-33的信號(hào)通路。
　　2.IL-33在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞

3、中的作用及機(jī)制研究
　　采用定量PCR檢測(cè)不同濃度的IL-33刺激D407細(xì)胞16h后其受體ST2LmRNA表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)100ng/mlIL-33刺激D407細(xì)胞16h后細(xì)胞表面受體ST2L表達(dá)；不同濃度的IL-33刺激D407細(xì)胞16h后，收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清，定量PCR和ELISA檢測(cè)炎癥因子IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-αmRNA和蛋白表達(dá)，探討IL-33因子對(duì)D407細(xì)胞的作用機(jī)制；加入NF-κB，ER

4、K1/2，JNK，p38MAPK信號(hào)通路抑制劑后，采用定量PCR及ELISA檢測(cè)100ng/mlIL-33刺激D407細(xì)胞16h后上述炎癥因子的表達(dá)，鑒定調(diào)控產(chǎn)生炎癥因子的信號(hào)通路。
　　結(jié)果：
　　1.IL-33在β-淀粉樣蛋白刺激人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的表達(dá)特性研究
　　1.10.3μMAβ1-40刺激組較正常組細(xì)胞形態(tài)變圓，胞體腫脹，細(xì)胞排列數(shù)量減少，細(xì)胞間間隙增加，且隨Aβ1-40刺激濃度增加變化明顯，而小于0

5、.3μMAβ1-40刺激組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。MTT檢測(cè)結(jié)果表明：隨著Aβ1-40刺激濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸下降，除了0.001μMAβ1-40刺激組外，其余各刺激組與正常對(duì)照組相比細(xì)胞存活率均顯著降低(P<0.05)。隨著0.3μM和1μMAβ1-40刺激D407細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率也逐漸下降，且與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P<0.05)。
　　1.2不同濃度Aβ1-40刺激D407細(xì)胞后，IL-33mRNA及蛋白表達(dá)

6、水平均增加，且在0.3μM刺激濃度時(shí)表達(dá)顯著增加(P<0.05)。結(jié)果提示：Aβ1-40刺激D407細(xì)胞后能夠引起IL-33表達(dá)上調(diào)。
　　1.3加入ERK1/2和p38MAPK信號(hào)通路抑制劑，0.3μMAβ1-40刺激D407細(xì)胞24h后，IL-33mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，但只有加入ERK1/2信號(hào)通路抑制劑后，細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-33蛋白水平才有明顯下降(P<0.05)。結(jié)果提示：Aβ1-40刺激D407細(xì)胞后

7、，IL-33的產(chǎn)生主要是通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路調(diào)控，而p38MAPK信號(hào)通路僅參與了IL-33轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。
　　2.IL-33在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的作用及機(jī)制研究
　　2.1IL-33因子刺激D407細(xì)胞后，ST2LmRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)，并隨著IL-33刺激濃度的增加而增加，且在100ng/mlIL-33刺激時(shí)表達(dá)量最高。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)D407細(xì)胞表面受體表達(dá)結(jié)果顯示：D407細(xì)胞表面ST2L表

8、達(dá)陽(yáng)性，且在100ng/mlIL-33因子刺激細(xì)胞16h后表達(dá)上調(diào)。
　　2.2采用定量PCR及ELISA檢測(cè)IL-33因子刺激D407細(xì)胞后炎癥因子IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-αmRNA及蛋白水平表達(dá)。結(jié)果顯示：20，50，100ng/mlIL-33刺激D407細(xì)胞16h后，炎癥因子mRNA及蛋白水平表達(dá)均顯著增加(P<0.05)，且隨著IL-33因子刺激濃度的增加，炎癥因子表達(dá)均逐漸增加，并在100ng/mlIL-

9、33刺激時(shí)表達(dá)量最高。結(jié)果提示：IL-33刺激D407細(xì)胞后IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-α因子表達(dá)上調(diào)。
　　2.3加入NF-κB，ERK1/2，JNK，p38MAPK信號(hào)通路抑制劑，100ng/mlIL-33刺激D407細(xì)胞16h后，定量PCR和ELISA檢測(cè)炎癥因子mRNA及蛋白水平表達(dá)，結(jié)果顯示：加入p38MAPK信號(hào)通路抑制劑后，IL-6表達(dá)顯著下降；加入ERK1/2信號(hào)通路抑制劑后，IL-8表達(dá)顯著下降；加入

10、NF-κB信號(hào)通路抑制劑后，IL-1β表達(dá)顯著下降；而加入JNK信號(hào)通路抑制劑后，TNF-α表達(dá)顯著下降(P<0.05)。結(jié)果表明：IL-33因子刺激D407細(xì)胞后炎癥因子IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-α的產(chǎn)生是分別通過(guò)p38MAPK，ERK1/2，NF-κB以及JNK信號(hào)通路調(diào)控。
　　結(jié)論：
　　1.隨著Aβ1-40刺激濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞存活率逐漸下降。
　　2.β-淀粉樣蛋白1

11、-40刺激人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞后能夠誘導(dǎo)IL-33因子轉(zhuǎn)錄及蛋白水平表達(dá)上調(diào)，且IL-33的產(chǎn)生主要是通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路調(diào)控，而p38MAPK信號(hào)通路僅參與了IL-33轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。
　　3.人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表面表達(dá)ST2L受體且隨著IL-33因子刺激濃度的增加ST2L表達(dá)量增加。
　　4.IL-33刺激人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞后能夠上調(diào)炎癥因子IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-α的表達(dá)。
　　5.在人視