Rab23在人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37遷移、侵襲和增殖中的作用.pdf

1、【背景】
　　乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,侵襲、轉(zhuǎn)移是影響乳腺癌病程發(fā)展的重要因素。Rab23分子最早在小鼠的裂腦缺陷(obp,openbrainphenotype)中發(fā)現(xiàn)[1],屬于Ras小GTP酶超家族成員,除了與腦、骨骼、四肢等的發(fā)育有關(guān)外[2],它還參與調(diào)控細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸,促進(jìn)了肝臟、胃等腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。前期我們課題組運(yùn)用RT-PCR技術(shù)、免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測(cè)出三種人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、Bcap-

2、37、MCF-7和正常乳腺細(xì)胞HBL-100中均有Rab23的表達(dá)[4],同時(shí),運(yùn)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和RNAi技術(shù)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)、BrdU摻入實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞技術(shù)和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)出在人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、Bcap-37、MCF-7中Rab23能夠在體外抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖,同時(shí)能夠降低Hedgehog信號(hào)通路的激活狀態(tài)[5]。但是,Rab23分子是否與乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)尚不清楚。因此,本課題旨在研究Rab2

3、3在乳腺癌細(xì)胞Bcap-37中的侵襲、遷移和增殖作用,為乳腺癌的防治提供新靶點(diǎn)。
　　【目的】
　　1.檢測(cè)Rab23在乳腺細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平,選擇合適的細(xì)胞系,通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和沉默Rab23的乳腺癌細(xì)胞系。
　　2.探討Rab23在體內(nèi)、外對(duì)人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37細(xì)胞侵襲、遷移的影響。
　　3.探討Rab23在體內(nèi)、外對(duì)人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37細(xì)胞增殖的影響。
　　【方法】

4、
　　1.運(yùn)用Westernblot方法檢測(cè)乳腺細(xì)胞HBL-100及乳腺癌細(xì)胞Bcap-37、MDA-MB-231、MCF-7中Rab23的表達(dá)。
　　2.構(gòu)建Rab23/GV278和Rab23/GV248表達(dá)質(zhì)粒,采用慢病毒轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37,通過(guò)篩選后建立穩(wěn)定的Rab23過(guò)表達(dá)細(xì)胞系Rab23/GV278-widetype和沉默細(xì)胞系(Rab23/GV248-RNAi＃1,Rab23/GV248-RNA

5、i＃2,Rab23/GV248-RNAi＃3)。
　　3.運(yùn)用Westernblot方法檢測(cè)Bcap-37細(xì)胞在過(guò)表達(dá)和沉默Rab23后Hedgehog信號(hào)通路激活水平重要標(biāo)志分子Gli1的表達(dá)。
　　4.運(yùn)用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Rab23對(duì)Bcap-37細(xì)胞體外遷移侵襲的影響。
　　5.運(yùn)用裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Rab23對(duì)Bcap-37細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響。
　　6.運(yùn)用MTT實(shí)驗(yàn)和平板

6、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Rab23對(duì)Bcap-37細(xì)胞體外增殖的影響。
　　7.運(yùn)用裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Rab23對(duì)Bcap-37細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響。
　　【結(jié)果】
　　1.Westernblot檢測(cè)顯示,Rab23在乳腺和乳腺癌細(xì)胞系中均有表達(dá),且Bcap-37細(xì)胞表達(dá)水平最高,與HBL-100細(xì)胞相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　2.建立了穩(wěn)定高表達(dá)和沉默Rab23乳腺癌Bcap-37細(xì)胞系。Wester

7、nblot檢測(cè)顯示,過(guò)表達(dá)Rab23的Bcap-37細(xì)胞Gli1表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),沉默Rab23的Bcap-37細(xì)胞Gli1表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。
　　3.劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空載體Bcap-37細(xì)胞相比,過(guò)表達(dá)Rab23的Bcap-37細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)(P<0.01),沉默Rab23的Bcap-37細(xì)胞遷移能力明顯減弱(P<0.01)。
　　4.細(xì)胞Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空

8、載體Bcap-37細(xì)胞相比,過(guò)表達(dá)Rab23的Bcap-37細(xì)胞侵襲遷移能力明顯增強(qiáng)(P<0.01),沉默Rab23的Bcap-37細(xì)胞侵襲遷移能力明顯減弱(P<0.01)。
　　5.裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)Rab23組的Bcap-37細(xì)胞腫瘤轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)(P<0.05),空載體組和沉默Rab23組的Bcap-37細(xì)胞均未見(jiàn)肺轉(zhuǎn)移;而在肝臟中均無(wú)轉(zhuǎn)移。
　　6.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空載體的Bcap-37細(xì)胞相比

9、,過(guò)表達(dá)Rab23的Bcap-37細(xì)胞增殖能力明顯減弱(P<0.01),沉默Rab23的Bcap-37細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.01)。
　　7.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空載體的Bcap-37細(xì)胞相比,過(guò)表達(dá)Rab23的Bcap-37細(xì)胞克隆形成數(shù)量明顯減少(P<0.05),沉默Rab23的Bcap-37細(xì)胞克隆形成數(shù)量明顯增多(P<0.01)。
　　8.裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空載體的Bcap-37細(xì)胞比較,過(guò)