Rab23在人乳腺癌細胞Bcap-37遷移、侵襲和增殖中的作用.pdf

1、【背景】
　　乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,侵襲、轉(zhuǎn)移是影響乳腺癌病程發(fā)展的重要因素。Rab23分子最早在小鼠的裂腦缺陷(obp,openbrainphenotype)中發(fā)現(xiàn)[1],屬于Ras小GTP酶超家族成員,除了與腦、骨骼、四肢等的發(fā)育有關(guān)外[2],它還參與調(diào)控細胞的囊泡運輸,促進了肝臟、胃等腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。前期我們課題組運用RT-PCR技術(shù)、免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測出三種人乳腺癌細胞MDA-MB-231、Bcap-

2、37、MCF-7和正常乳腺細胞HBL-100中均有Rab23的表達[4],同時,運用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和RNAi技術(shù)、克隆形成實驗、MTT實驗、BrdU摻入實驗、流式細胞技術(shù)和RT-PCR技術(shù)檢測出在人乳腺癌細胞MDA-MB-231、Bcap-37、MCF-7中Rab23能夠在體外抑制乳腺癌細胞的生長和增殖,同時能夠降低Hedgehog信號通路的激活狀態(tài)[5]。但是,Rab23分子是否與乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)尚不清楚。因此,本課題旨在研究Rab2

3、3在乳腺癌細胞Bcap-37中的侵襲、遷移和增殖作用,為乳腺癌的防治提供新靶點。
　　【目的】
　　1.檢測Rab23在乳腺細胞和乳腺癌細胞中的表達水平,選擇合適的細胞系,通過慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建穩(wěn)定過表達和沉默Rab23的乳腺癌細胞系。
　　2.探討Rab23在體內(nèi)、外對人乳腺癌細胞Bcap-37細胞侵襲、遷移的影響。
　　3.探討Rab23在體內(nèi)、外對人乳腺癌細胞Bcap-37細胞增殖的影響。
　　【方法】

4、
　　1.運用Westernblot方法檢測乳腺細胞HBL-100及乳腺癌細胞Bcap-37、MDA-MB-231、MCF-7中Rab23的表達。
　　2.構(gòu)建Rab23/GV278和Rab23/GV248表達質(zhì)粒,采用慢病毒轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染人乳腺癌細胞Bcap-37,通過篩選后建立穩(wěn)定的Rab23過表達細胞系Rab23/GV278-widetype和沉默細胞系(Rab23/GV248-RNAi＃1,Rab23/GV248-RNA

5、i＃2,Rab23/GV248-RNAi＃3)。
　　3.運用Westernblot方法檢測Bcap-37細胞在過表達和沉默Rab23后Hedgehog信號通路激活水平重要標(biāo)志分子Gli1的表達。
　　4.運用劃痕愈合實驗、細胞Matrigel侵襲實驗檢測Rab23對Bcap-37細胞體外遷移侵襲的影響。
　　5.運用裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移實驗檢測Rab23對Bcap-37細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響。
　　6.運用MTT實驗和平板

6、克隆形成實驗檢測Rab23對Bcap-37細胞體外增殖的影響。
　　7.運用裸鼠皮下成瘤實驗檢測Rab23對Bcap-37細胞體內(nèi)增殖的影響。
　　【結(jié)果】
　　1.Westernblot檢測顯示,Rab23在乳腺和乳腺癌細胞系中均有表達,且Bcap-37細胞表達水平最高,與HBL-100細胞相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　2.建立了穩(wěn)定高表達和沉默Rab23乳腺癌Bcap-37細胞系。Wester

7、nblot檢測顯示,過表達Rab23的Bcap-37細胞Gli1表達水平明顯降低(P<0.05),沉默Rab23的Bcap-37細胞Gli1表達水平明顯升高(P<0.05)。
　　3.劃痕愈合實驗結(jié)果顯示,與空載體Bcap-37細胞相比,過表達Rab23的Bcap-37細胞遷移能力明顯增強(P<0.01),沉默Rab23的Bcap-37細胞遷移能力明顯減弱(P<0.01)。
　　4.細胞Matrigel侵襲實驗結(jié)果顯示,與空

8、載體Bcap-37細胞相比,過表達Rab23的Bcap-37細胞侵襲遷移能力明顯增強(P<0.01),沉默Rab23的Bcap-37細胞侵襲遷移能力明顯減弱(P<0.01)。
　　5.裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移實驗結(jié)果顯示,過表達Rab23組的Bcap-37細胞腫瘤轉(zhuǎn)移能力明顯增強(P<0.05),空載體組和沉默Rab23組的Bcap-37細胞均未見肺轉(zhuǎn)移;而在肝臟中均無轉(zhuǎn)移。
　　6.MTT實驗結(jié)果顯示,與空載體的Bcap-37細胞相比

9、,過表達Rab23的Bcap-37細胞增殖能力明顯減弱(P<0.01),沉默Rab23的Bcap-37細胞增殖能力明顯增強(P<0.01)。
　　7.平板克隆形成實驗結(jié)果顯示,與空載體的Bcap-37細胞相比,過表達Rab23的Bcap-37細胞克隆形成數(shù)量明顯減少(P<0.05),沉默Rab23的Bcap-37細胞克隆形成數(shù)量明顯增多(P<0.01)。
　　8.裸鼠皮下成瘤實驗結(jié)果顯示,與空載體的Bcap-37細胞比較,過