高通量低能量激光促凋亡過程中survivin對細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、低能量激光照射（LOW-power laser irradiation，LPLI），以前又稱低強(qiáng)度或低功率激光照射，作為一種無損的物理手段可以調(diào)控多種生物過程，比如細(xì)胞增殖和分化，細(xì)胞活力，以及細(xì)胞凋亡。LPLI在相對低的劑量下對細(xì)胞增殖有一個(gè)刺激效應(yīng)，但在高劑量則有一個(gè)抑制效應(yīng)。近期研究表明，60～120 J/cm2的LPLI劑量能夠誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡，并且這種誘導(dǎo)作用是激光劑量依賴的。眾所周知，當(dāng)一個(gè)穩(wěn)定的生物系統(tǒng)（例如細(xì)胞）受到外

2、界刺激的時(shí)候，會(huì)表現(xiàn)出一種自我保護(hù)效應(yīng)，來抵抗外界刺激。但是高通量低能量激光（High fluence low-power laser irradition，HF-LPLI）誘導(dǎo)凋亡的過程中的細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制仍未被研究。這種機(jī)制的研究對于HF-LPLI將來可能的臨床應(yīng)用是必要的。因?yàn)閟urvivin在多種刺激（例如UV，PDT，cisplatin）下都能夠介導(dǎo)一種負(fù)向反饋的細(xì)胞自我保護(hù)作用。因此，我們對于survivin在HF-LPLI

3、刺激下活性的變化以及其抗凋亡作用的發(fā)揮進(jìn)行了研究。
　　 研究方法及結(jié)果如下：
　　 1，HF-LPLI能夠通過ROS/cdc25c/CDK1通路激活survivin
　　 本文使用western blot技術(shù)檢測了HF-LPLI處理后survivin第34位蘇氨酸的磷酸化水平的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在HF-LPLI處理后1小時(shí)，survivin的磷酸化水平即活化水平顯著上升。然后，同樣利用western blot

4、技術(shù)，我們在HF-LPLI刺激的同時(shí)加入ROS清除劑以及CDK1抑制劑的情況下，檢測survivin的磷酸化水平。結(jié)果顯示，ROS清除劑或者CDK1抑制劑都顯著地抑制了HF-LPLI上調(diào)的survivin磷酸化活化水平。因此，我們得到結(jié)論，HF-LPLI能夠激活survivin，并且這種激活作用是依賴于ROS產(chǎn)生以及CDK1的活性。
　　 2，survivin活性的上升抑制了HF-LPLI誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，而survivin活

5、性的下降則促進(jìn)了凋亡。
　　 首先，我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的效率大于40％，是一個(gè)有效地蛋白過表達(dá)方法。之后，我們應(yīng)用western blot技術(shù)檢測了過表達(dá)WT/T34A-survivin對于細(xì)胞中survivin蛋白活性的影響。結(jié)果表明，過表達(dá)WT-survivin增加了總的survivin蛋白活性，而過表達(dá)T34A-survivin則降低了總的survivin蛋白活性。之后我們應(yīng)用C

6、CK-8細(xì)胞活力檢測、流式凋亡檢測以及克隆形成檢測這三種方法，研究了過表達(dá)WT/T34A-survivin對于HF-LPLI誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低、細(xì)胞凋亡以及HF-LPLI處理效力的影響。結(jié)果表明，過表達(dá)WT-survivin顯著地抑制了HF-LPLI誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低、細(xì)胞凋亡以及HF-LPLI處理效力，而過表達(dá)T34A-survivin則增加了凋亡率以及處理效力。這些結(jié)果說明，survivin活性的上升抑制了HF-LPLI誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)

7、胞凋亡，而survivin活性的下降則促進(jìn)了凋亡。
　　 3，survivin能夠延緩HF-LPLI誘導(dǎo)的線粒體去極化，細(xì)胞色素C釋放，caspase-9以及Bax的激活。
　　 我們應(yīng)用單個(gè)活細(xì)胞的實(shí)時(shí)監(jiān)測技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、多細(xì)胞熒光光譜分析以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)研究了survivin對于HF.LPLI誘導(dǎo)的關(guān)鍵凋亡事件的影響。研究結(jié)果顯示，survivin延緩了HF-LPLI誘導(dǎo)的線粒體去極化、細(xì)胞色素C釋放、ca