以明膠酶為靶點的小型化抗體與力達霉素構(gòu)建的基因工程強化融合蛋白及其抗腫瘤活性的研究.pdf

1、抗體-藥物偶聯(lián)物的開發(fā)是當前抗腫瘤藥物研發(fā)的一個重要發(fā)展方向，然其成功的發(fā)展在某種程度上有賴于抗體部分的靶向運輸能力和被輸送藥物的生物學活性。明膠酶在多種腫瘤中高表達，且在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管生成中發(fā)揮著重要的作用，來源于小鼠的單克隆抗體3G11具有特異性結(jié)合明膠酶的特性。力達霉素是一個高效的抗腫瘤大分子抗生素，以單克隆抗體3G11為基礎，結(jié)合力達霉素的特性，我們構(gòu)建了多種類型的基因工程融合蛋白。為了進一步增強抗體片段對明膠酶高表達

2、腫瘤細胞的靶向能力和提高抗腫瘤效果，我們作了以下的研究和探索。
　　 一、抗明膠酶的雙單鏈抗體和力達霉素的融合蛋白dFv-LDP制備及其體內(nèi)的靶向能力研究
　　 隨著抗體工程的研究進展，目前認為雙價的單鏈抗體片段具有最佳的腫瘤靶向能力。為了進一步提高前期所構(gòu)建的抗明膠酶單鏈抗體和力達霉素融合蛋白Fv-LDP-AE的抗腫瘤效果，我們構(gòu)建了含有2個scFv和力達霉素輔基蛋白的融合蛋白，將其命名為dFv-LDP。表達該重組蛋白

3、的質(zhì)粒pET30a（+）/dFv-LDP經(jīng)過酶切鑒定和序列測定后，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌BL21（DE3）和Rosetta（DE3）pLysS中，進行誘導表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)融合蛋白dFv-LDP更易于在Rosetta（DE3）pLysS中表達，產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在，目的蛋白經(jīng)純化、復性后，每升發(fā)酵液可以獲得50 mg純度達到95％以上有活性的dFv-LDP融合蛋白?？乖璄LISA結(jié)果表明，融合蛋白dFv-LDP與抗原明膠酶的親和常數(shù)為0.04

4、3μM，比單鏈的Fv-LDP融合蛋白的親和力提高了4倍左右。融合蛋白dFv-LDP亦能與腫瘤細胞特異性結(jié)合，對Be1-7402、PG-BE1、HT-1080、HepG2、MCF-7等腫瘤細胞均呈陽性免疫反應。流式細胞術(shù)分析表明融合蛋白dFv-LDP在一定程度上能被細胞內(nèi)吞，相對單鏈的Fv-LDP來說比率有所增加，但總體不太明顯。體內(nèi)的靶向?qū)嶒炛校诤系鞍譫Fv-LDP具有比單鏈的Fv-LDP更優(yōu)越的腫瘤靶向能力，在人肝癌Be1-7402

5、、高轉(zhuǎn)移肺癌PG-BE1和結(jié)腸癌HCT-116裸鼠異位移植瘤中展現(xiàn)了優(yōu)良的靶向能力，能夠很快在腫瘤部位富集。因此，本實驗構(gòu)建的雙單鏈抗體融合蛋白dFv-LDP具有良好的腫瘤靶向能力，有望在同等條件下攜帶更多的力達霉素分子到達腫瘤部位，從而提高抗腫瘤效果并降低對非靶器官的損傷。
　　 二、融合蛋白dFv-LDP與發(fā)色團AE的組裝條件的優(yōu)化
　　 力達霉素是一個大分子抗腫瘤抗生素，可以拆分為一個輔基蛋白和一個高活性的發(fā)色團。

6、該發(fā)色團可以和基因工程表達的含有力達霉素輔基蛋白結(jié)構(gòu)域的重組融合蛋白組裝，構(gòu)建具有高度活性的強化融合蛋白。然而這種組裝效率受一些因素的影響，本文利用融合蛋白dFv-LDP和發(fā)色團AE組裝作為一個研究對象，擬對這些影響因素進行分析和研究。利用高效液相色譜分析不同摩爾濃度的力達霉素并建立其發(fā)色團和輔基蛋白摩爾濃度的標準曲線；在此基礎上利用L9（34）正交設計分析組裝時的溫度、時間、pH以及發(fā)色團和基因工程融合蛋白dFv-LDP的摩爾比率4個

7、因素對組裝效率的影響，挑選最優(yōu)組裝效率的組合。結(jié)果建立了力達霉素發(fā)色團和輔基蛋白摩爾濃度的標準曲線，所選擇的4個因素對組裝效率都有明顯的的影響（P<0.01），其影響程度先后順序是溫度>時間>pH>發(fā)色團和融合蛋白dFv-LDP濃度的比率；最優(yōu)的組裝條件為溫度10℃，時間12h，pH7.0和發(fā)色團與蛋白摩爾比率為5:1。經(jīng)過優(yōu)化后，融合蛋白dFv-LDP與發(fā)色團的組裝效率提高了20％左右。該優(yōu)化組裝條件對其他基因工程表達的含有力達霉素輔

8、基蛋白的融合蛋白與發(fā)色團組裝有一定的參考價值。
　　 三、強化融合蛋白dFv-LDP-AE的體內(nèi)抗腫瘤作用研究
　　 小動物活體成像表明融合蛋白dFv-LDP具有很好的腫瘤靶向效果，當其與發(fā)色團AE組裝后，我們進一步評價其體內(nèi)的抗腫瘤效果。MTT法表明強化融合蛋白dFv-LDP-AE具有不亞于力達霉素的對多種腫瘤細胞強烈的殺傷能力，IC50值介于1×10-10～10-12M之間。小鼠肝癌H22抑瘤實驗表明，在等摩爾的情況

9、下，強化融合蛋白dFv-LDP-AE比單價的Fv-LDP-AE有更高的抗腫瘤能力（89.5％ vs84.2％），兩者都較單獨的力達霉素（73.6％）有明顯的提高（P<0.05），說明抗體攜帶力達霉素的靶向治療能夠提高力達霉素的治療效果；在肝癌Be1-7402裸鼠移植瘤中，dFv-LDP-AE也展現(xiàn)了更好的抗腫瘤效果，0.4 mg/kg，0.6 mg/kg，0.8 mg/kg三個劑量的dFv-LDP-AE的抑瘤率分別為64.2％、73.1

10、％和87.3％，均強于力達霉素的63.4％抑瘤率。而0.48 mg/kg的Fv-LDP-AE的抑瘤率為73.9％，小于等摩爾濃度下的（0.8 mg/kg）dFv-LDP-AE的抑瘤效果（P<0.05；dFv-LDP-AE（0.8 mg/kg）vs Fv-LDP-AE（0.48 mg/kg））。說明通過增加一個Fv片段，在可耐受劑量下提高了抑瘤效果，降低了對非靶器官的毒副作用。
　　 抗原從腫瘤脫落是抗體-藥物偶聯(lián)物治療的一個需要

11、考慮的問題，同時也為了進一步提高強化融合蛋白dFv-LDP-AE的抗腫瘤效果，我們嘗試了新的給藥方案，即大劑量融合蛋白dFv-LDP聯(lián)合小劑量強化融合蛋白dFv-LDP-AE。在肺癌PG-BE1裸鼠移植瘤中，融合蛋白dFv-LDP在10 mg/kg的抑瘤率為77％，強化融合蛋白dFv-LDP-AE在0.4 mg/kg和0.6 mg/kg時的抑瘤率分別為91.3％和94.2％，較之dFv-LDP融合蛋白有明顯的提高（P<0.05）；但兩者

12、聯(lián)合后，抑瘤率進一步增加，兩組6個老鼠中都有5個裸鼠的腫瘤體積較治療前縮小了，縮小的百分率分別為22.0％和49.6％，說明這種聯(lián)合給藥的方案是有效的，免疫組化檢測微血管密度CD31和核增值因子Ki-67也證明了這種增效作用。該實驗說明融合蛋白dFv-LDP、強化融合蛋白dFv-LDP-AE以及兩者的聯(lián)合可逐步提高抗腫瘤效果。
　　 纖維肉瘤是一種明膠酶高表達的腫瘤，我們以熒光素酶穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的纖維肉瘤HT-1080為研究對象，建立

13、了其實驗性肺轉(zhuǎn)移的模型，F(xiàn)ITC標記的融合蛋白具有明顯靶向?qū)嶒炐苑无D(zhuǎn)移灶的特性。在裸鼠體內(nèi)試驗中，采用融合蛋白dFv-LDP、強化融合蛋白dFv-LDP-AE以及兩者聯(lián)合給藥的方式比較了三者在HT-1080的實驗性肺轉(zhuǎn)移中的抑制作用。融合蛋白dFv-LDP（10 mg/kg）展現(xiàn)了不錯的抗轉(zhuǎn)移的作用，肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)目為對照組的55.8％（P<0.01，與對照組相比）；強化融合蛋白dFv-LDP-AE在0.4和0.6 mg/kg的劑量下的轉(zhuǎn)

14、移灶數(shù)目分別為對照組的41.4％和25.1％（P<0.05，與dFv-LDP10 mg/kg組相比）；聯(lián)合dFv-LDP后，其肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)目進一步下降，僅為對照組的20.3％（P<0.05，與dFV-LDP-AE0.4 mg/kg組相比）和13.1％（P<0.05，與dFv-LDP-AE0.6 mg/kg組相比），說明通過聯(lián)合給藥的方式，進一步提高了抗轉(zhuǎn)移的效果。融合蛋白dFv-LDP和強化融合蛋白dFv-LDP-AE的聯(lián)合應用在臨床纖

15、維肉瘤的治療中有潛在的應用前景。
　　 四、抗明膠酶scFv的重鏈CDR3區(qū)與力達霉素構(gòu)建的基因工程強化融合蛋白及其抗腫瘤作用研究
　　 大劑量未加強化的融合蛋白與小劑量強化的的融合蛋白聯(lián)合能夠進一步提高抗腫瘤的效果，但也可能導致免疫原性的增加。為了降低可能發(fā)生的免疫原性，我們做了以下的探索，構(gòu)建、表達和純化了僅有scFv重鏈CDR3區(qū)與力達霉素輔基蛋白的CDR3-LDP和CDR3-LDP-CDR3兩種融合蛋白?？乖璄L

16、ISA表明融合蛋白CDR3-LDP和CDR3-LDP-CDR3兩者的親和力差別不大，與明膠酶的親和常數(shù)Kd值分別為5.78 x10-6和6.563 x10-6M。免疫熒光分析表明融合蛋白CDR3-LDP與腫瘤細胞M21、HepG2結(jié)合呈陽性。強化后的融合蛋白CDR3-LDP-AE具有強烈的抗腫瘤活性，對Be1-7402和HepG2的IC50分別為1.05x10-11和6.6x10-14mol/L。小鼠肝癌H22動物實驗中，融合蛋白CDR

17、3-LDP（10 mg/kg）的抑瘤率為56％；強化融合蛋白CDR3-LDP-AE在0.25和0.5 mg/kg的劑量抑瘤率分別為78.8％和87.1％（P<0.05，與融合蛋白CDR3-LDP相比）；兩者聯(lián)合后，腫瘤抑制率分別提高到85.2％（P<0.05，與CDR3-LDP-AE0.25 mg/kg相比）和92.7％（P<0.05，與CDR3-LDP-AE0.5 mg/kg相比）。
　　 綜上所述，雙價的融合蛋白dFv-LD