X射線及聯(lián)合CCR7-siRNA對(duì)肺癌A549細(xì)胞體外增殖、侵襲及遷移能力影響.pdf

1、目的:
　　 研究不同劑量X射線照射對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞CCR7 mRNA及蛋白表達(dá)的影響；在此基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)CCR7 mRNA的干擾RNA(CCR7-siRNA)并轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,研究X射線照射及聯(lián)合CCR7-siRNA對(duì)A549細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的影響,為肺癌侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為放療聯(lián)合RNA干擾技術(shù)治療肺癌的臨床應(yīng)用提供新思路。
　　 方法:
　　 以Precise直線加速器產(chǎn)

2、生的X射線照射體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞(劑量率為442.89 cGy／min),以RT-PCR技術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞CCR7 mRNA表達(dá)水平；以Westernblotting方法檢測(cè)A549細(xì)胞CCR7蛋白表達(dá)水平；以生物信息學(xué)手段,設(shè)計(jì)靶向CCR7 mRNA的干擾RNA(CCR7-siRNA),構(gòu)建CCR7-siRNA慢病毒載體,轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞；以MTT法、Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕法分別檢測(cè)不同劑量輻射及CCR7-siRNA

3、對(duì)A549細(xì)胞體外增殖、侵襲及遷移能力影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.以未照射組為對(duì)照組,2 Gy組在照射后24 h及96 h A549細(xì)胞的增殖水平顯著高于對(duì)照組(0.087±0.002 VS0.075±0.001,0.449±0.009 VS0.252±0.018,P<0.05),120 h低于對(duì)照組(0.509±0.060 VS0.738±0.087,P<0.05)；4 Gy組在照射后24 h高于對(duì)照組(0.087

4、±0.001 VS0.075±0.001,P<0.05),之后的增殖水平除72 h組外均低于對(duì)照組(0.088±0.008 VS0.127±0.006,0.182±0.012 VS0.252±0.018,O.571±0.064 VS0.738±0.087,P<0.05):6 Gy組在照射48、72、120 h的增殖水平分別為0.072±0.002、0.138±0.030、0.365±0.024,均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；8 Cy

5、組在照射72 h之后各組的增殖水平分別為0.155±0.038、0.139±0.015、0.248±0.016,均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。
　　 2.以Transwell侵襲小室法檢測(cè)A549細(xì)胞體外侵襲能力,對(duì)照組未見(jiàn)穿膜細(xì)胞,各照射組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為22.67±3.32、1.83±0.41、3.00±1.10、4.67±2.16,與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),以2 Gy組穿膜細(xì)胞最多(22.67±3.3

6、2,P<0.01)；細(xì)胞劃痕法檢測(cè)體外遷移能力發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,照射后24 h,2 Gy、4 Gy和6 Gy組細(xì)胞的遷移能力顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而8 Cy組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；照射后48 h,只有2Gy組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；且2 Gy組與其它照射組間有顯著差異(P<0.05)。
　　 3.A549細(xì)胞在照射4 h后,4 Gy、6 Gy和8 Gy組CCR7 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量開(kāi)始升高(P

7、<0.05)；在高峰后逐漸下降,6 Gy和8 Gy組在照射72 h后mRNA表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05),2 Gy和6 C,y組在照射72 h后CCR7蛋白相對(duì)表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而4 Gy和8 Cy組在照射48 h后降至對(duì)照組水平(P>0.05)。
　　 4.以生物信息學(xué)技術(shù)設(shè)計(jì)2條靶向CCR7 mRNA的CCR7-siRNA,構(gòu)建慢病毒載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。與對(duì)照組比較,轉(zhuǎn)染的2條CCR7-si

8、RNA組均可顯著降低A549細(xì)胞CCR7 mRNA及蛋白表達(dá)水平(0.39±0.05 VS0.87±0.04,0.59±0.19 VS1.00±0.00,P<0.05)；設(shè)計(jì)合成的兩對(duì)干擾序列相比,以CCR7 siRNA-1序列的干擾效果較為顯著(0.39±0.05 VS0.50±0.04,0.59±0.19 VS0.93±0.07,P<0.05),用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
　　 5.與單純照射組比較,CCR7-siRNA聯(lián)合照射組可

9、顯著降低CCR7 mRNA及蛋白表達(dá)水平(0.56±0.05 VS1.20±0.20,0.32±O.06 VS1.88±0.13,P<0.05)以及A549細(xì)胞體外增殖、侵襲、遷移能力(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 一定劑量(2 Gy-8 Gy)X射線照射A549細(xì)胞后一定時(shí)間內(nèi)可顯著提高A549細(xì)胞CCR7 mRNA及蛋白的表達(dá)水平并能促進(jìn)A549細(xì)胞的體外侵襲、遷移,并在一定時(shí)間內(nèi)抑制A549細(xì)胞的體外增殖能