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文檔簡介
1、本研究使用測序菌株作陽性對照,藥敏質(zhì)控菌ATCC25922抽提的DNA作陰性對照,建立了動(dòng)物源細(xì)菌對四環(huán)素類藥物耐藥基因三重PCR檢測方法。同時(shí),針對Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物等組份用量及退火溫度、循環(huán)次數(shù)等循環(huán)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化并組裝試劑盒。優(yōu)化結(jié)果如下:10×PCRBuffer5μL,濃度為25mM/LMgCl23.0μL,濃度各為2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物4μL,濃度為2.5U/ULTaq
2、DNA聚合酶0.35μL,濃度掃為25mmol/L三種耐藥基因即tetA基因、tetC基因和tetM基因的特異性上下游引物(25mmol/L)分別1.0μL、0.3μL、0.4μL。將其置于一無菌的PCR反應(yīng)薄壁管中,加入已制備好的模板5μL,補(bǔ)水至總體積50μL后加入20μL礦物油封頂即可。經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)對試劑盒的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,最優(yōu)PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性5min;然后進(jìn)入循環(huán):94℃變性60s、56℃退火60s、72℃延
3、伸60s,共35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min后,電泳觀察結(jié)果。 應(yīng)用本檢測試劑盒和傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)方法(K-B法)對100株細(xì)菌的耐藥基因型和表型同時(shí)進(jìn)行檢測,并比較兩者檢測過程和檢測結(jié)果。結(jié)果表明,細(xì)菌對四環(huán)素的耐藥率最高為:92%(92/100),對多西環(huán)素的耐藥率次之,為:84%(84/100),對米諾環(huán)素耐藥率相對最低,為:75%(75/100)。在100株待檢細(xì)菌中,tetA基因的檢出率為46%(46/100),tet
4、C基因的檢出率為:38%(38/100),tetM基因的檢出率為:33%(33/100)。兩種方法檢出結(jié)果的符合率為89%。比較常規(guī)的耐藥基因檢測方法:單重PCR方法與試劑盒采用的三重PCR方法,檢測結(jié)果符合率為100%。 在此基礎(chǔ)上,對試劑盒特異性、敏感性、重復(fù)性和保質(zhì)期等進(jìn)行了系統(tǒng)的檢測試驗(yàn)。檢測結(jié)果表明:本試劑盒具有極強(qiáng)的特異性,只能特異性擴(kuò)增出目的耐藥基因。本試劑盒具有很高的靈敏度(4.0×104cfu/mL);并且性能
5、穩(wěn)定,顯示出了很好的批內(nèi)和批間重復(fù)性(100%)。試劑盒在-20℃下的保質(zhì)期為6個(gè)月。 利用研制的試劑盒,對我國24個(gè)省的樣品進(jìn)行了耐藥性檢測。結(jié)果顯示,不同種屬的動(dòng)物源細(xì)菌、不同來源動(dòng)物,不同年代大腸桿菌四環(huán)素類藥物耐藥基因分布存在很大的差異。從70年代到今天,不同年代大腸桿菌tet基因的檢出率呈明顯上升的趨勢。 本研究率先在國內(nèi)外建立了動(dòng)物源細(xì)菌四環(huán)素類藥物耐藥基因三重PCR檢測試劑盒,并進(jìn)行了初步應(yīng)用,這在國內(nèi)外均
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