高血壓大鼠局灶性大腦皮層梗死后同側(cè)丘腦β淀粉樣蛋白沉積與繼發(fā)性損害研究.pdf

1、研究背景：
　　 腦梗死是中老年人常見病、多發(fā)病,具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高的特點,而且發(fā)病率呈上升及年輕化趨勢,嚴重危及人類健康,給個人、家庭和社會帶來沉重的負擔。隨著神經(jīng)影像技術(shù)的飛速發(fā)展,腦梗死臨床診斷水平有了質(zhì)的飛躍,但治療形勢仍非常嚴峻,目前除了超早期溶栓治療的有效性得到肯定之外,仍缺乏其他確實可靠的臨床特效治療,但溶栓治療受到嚴格適應(yīng)癥的限制,特別是治療時間窗的限制,而且溶栓治療也有一定繼發(fā)性出血的風險,故真正

2、能從溶栓治療中獲益的腦梗死患者比例非常小。造成腦梗死治療困難,致死、致殘率高的重要因為之一是對腦梗死病理生理等發(fā)病機制仍缺乏深入了解。因此,通過研究腦梗死的發(fā)病機制來探索新的有效治療策略成為腦梗死研究領(lǐng)域的當務(wù)之急。
　　 目前,有關(guān)腦梗死方面的研究無論是臨床研究還是基礎(chǔ)研究,都主要集中在如何減輕梗死灶局部的神經(jīng)組織損傷和增強缺血周圍組織的代償能力,從而改善神經(jīng)功能,但對腦梗死后遠隔部位的繼發(fā)性損害極少關(guān)注。尸體解剖()動物實驗

3、和神經(jīng)影像學研究均發(fā)現(xiàn):局灶性大腦皮層梗死后不僅導致相應(yīng)供血區(qū)的腦組織神經(jīng)細胞死亡,而且對非缺血的但與原發(fā)病灶有著突觸聯(lián)系的遠隔部位(例如:丘腦、黑質(zhì)、脊髓等)也可以引起繼發(fā)性損害,并影響神經(jīng)功能的恢復。因為丘腦不屬于大腦中動脈供血區(qū),大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occulusion,MCAO)后同側(cè)丘腦繼發(fā)性損害是局灶性腦梗死后繼發(fā)性遠隔損害的典型代表,也是該領(lǐng)域的研究熱點。腦梗死后遠隔部位繼發(fā)性損害

4、的具體發(fā)生機制目前尚未完全闡明。
　　 β淀粉樣蛋白(beta-amyloid,Aβ)是阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)特征性病理改變老年斑的主要成份。Aβ是公認的神經(jīng)毒性分子,它在腦內(nèi)異常沉積對AD發(fā)病起核心作用。Aβ是由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)經(jīng)β-和γ-分泌酶水解后產(chǎn)生的,抑制β-或γ-分泌酶均能有效減少Aβ生成。因為γ-分泌酶是APP水解產(chǎn)生

5、Aβ的最后一步,也是決定Aβ變體長度的關(guān)鍵,所以γ-分泌酶抑制劑被認為是治療AD很有前景的藥物。N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S—phenylglycine t-butyl ester(DAPT)是γ-分泌酶抑制劑的一種,具有高度選擇性,研究發(fā)現(xiàn)口服DAPT能有效降低動物血漿、腦脊液及大腦皮質(zhì)或海馬Aβ水平,且呈劑量依賴性,并能顯著改善AD小鼠的認知功能。近年來,研究發(fā)現(xiàn)Aβ在腦內(nèi)的異常

6、沉積并非AD所特有,MCAO后不僅梗死灶周邊有Aβ異常沉積,而且同側(cè)丘腦也有Aβ異常沉積現(xiàn)象,但Aβ在丘腦沉積后的作用目前仍不清楚。
　　 建立在易卒中型腎血管性高血壓大鼠(stroke—prone renovascular hypertensiverats,RHRSP)基礎(chǔ)上的電凝法局灶性大腦皮層梗死模型(MCAO)不僅能較好地模擬臨床上腦卒中的高血壓危險因素,而且高血壓大鼠側(cè)支循環(huán)較正常血壓鼠更差,可復制出高梗死發(fā)生率的局灶

7、性腦梗死模型。此外,電凝法MCAO模型的梗死灶局限于大腦皮層,不影響后循環(huán)的血供,所以利用該模型來研究MCAO后遠隔丘腦部位繼發(fā)性損害具有獨特優(yōu)勢。
　　 研究目的：
　　 本課題分為兩部分:第一部分,在RHRSP基礎(chǔ)上建立MCAO模型,動態(tài)觀察Aβ表達情況,探討MCAO后Aβ表達的變化規(guī)律:第二部分,利用γ-分泌酶抑制劑(DAPT)進行干預(yù),觀察比較干預(yù)組與對照組之間丘腦Aβ沉積、丘腦繼發(fā)性損害程度以及神經(jīng)功能的差異,

8、探討Aβ異常沉積是否對丘腦具有損害作用及對神經(jīng)功能的影響。
　　 材料和方法：
　　 第一部分:高血壓大鼠局灶性大腦皮層梗死后Aβ表達的動態(tài)觀察
　　 選取體重70～90 g雄性SD大鼠70只按雙腎雙夾法復制成RHRSP模型并監(jiān)測血壓。RHRSP術(shù)后12 w,選取血壓穩(wěn)定高于180 mmHg,且無明顯腦卒中征象的高血壓大鼠53只,按電凝法成功復制左側(cè)MCAO模型30只,另隨機選取18只作為假手術(shù)組,該兩大組又隨機

9、分為6個小組,每小組含MCAO組5只,假手術(shù)組3只,分別在MCAO或假手術(shù)后24 h、2 d、3 d、7 d、21 d、28 d處死,其中術(shù)后24 h組用于2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色以明確梗死灶分布,其余時間點均用于Aβ免疫組織化學檢查,以及Aβ/NeuN、Aβ/GFAP和Aβ/OX-42免疫熒光雙標以觀察Aβ表達及其與細胞共定位情況。
　　 第二部分:高血壓大鼠局灶性大腦皮層梗死后同側(cè)丘腦Aβ沉積與繼發(fā)性損害研

10、究
　　 選取體重70～90 g雄性SD大鼠60只按雙腎雙夾法復制成RHRSP模型并監(jiān)測血壓。RHRSP術(shù)后12 w,選取血壓穩(wěn)定高于180 mmHg,且無明顯腦卒中征象的高血壓大鼠52只,按電凝法成功復制左側(cè)MCAO模型36只,隨機分為MCAO組、溶劑對照組和DAPT組,每組12只,另隨機選取12只作為假手術(shù)組。MCAO術(shù)后72 h,DAPT組大鼠經(jīng)一次性灌胃給予DAPT溶液[50 mg/kg,溶劑為5％(體積比)酒精玉米油溶

11、液,總體積為10 ml/kg]；溶劑對照組大鼠給予等體積不含DAPT的溶劑:MCAO組和假手術(shù)組大鼠不給予任何灌胃處理。MCAO術(shù)后7 d采用粘貼物移除實驗和提高后軀體擺動實驗分別對感覺和運動功能進行評價,神經(jīng)功能評價結(jié)束后分別從每組隨機選取8只大鼠進行灌注取腦冰凍切片,Nissl染色觀測梗死灶體積和丘腦組織學變化,免疫組織化學檢查觀測丘腦Aβ沉積程度以及丘腦腹后核(ventroposterior nucleus of the thal

12、amus,VPN)NeuN和OX-42免疫陽性細胞數(shù)；每組剩余的4只大鼠進行灌注取丘腦提取總Aβ x-42蛋白用于酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme—linked immunosorbent assay,ELISA)檢測丘腦Aβ x-42水平。
　　 除丘腦Aβ免疫陽性面積以中位數(shù)(四分位間距)表示,并采用非參數(shù)檢驗(Kruskal—Wallis test followed by Mann-Whitney U test)進行多組間比

13、較外,其余數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準誤表示,并采用Student-t test進行兩組間比較,單因素方差分析(ANOVA followed by Bonferroni test)進行多組問比較。此外,對MCAO術(shù)后7 d同側(cè)丘腦VPN內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量與大鼠的右前肢感覺、運動功能評分或同側(cè)丘腦Aβ免疫陽性面積之間的相關(guān)關(guān)系進行Spearman相關(guān)分析。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0 for windows進行統(tǒng)計分析,P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

14、r>　　 結(jié)果：
　　 一、第一部分結(jié)果
　　 1、TTC染色
　　 假手術(shù)組全腦組織均呈紅色著色:MCAO組術(shù)后24 h除左側(cè)額、顳、項區(qū)未著色外其余腦組織呈紅色著色。
　　 2、Aβ免疫組織化學及Aβ/NeuN、Aβ/GFAP和Aβ/OX-42免疫熒光雙標檢查
　　 假手術(shù)組全腦組織在各時間點均未見Aβ免疫陽性信號；MCAO組術(shù)后在梗死灶周邊和同側(cè)丘腦均有Aβ表達,并具有以下3個特點:

15、>　　 2.1 Aβ表達時間及表達量變化:在梗死灶周邊:MCAO術(shù)后2 d細胞內(nèi)出現(xiàn)Aβ免疫強陽性信號；3 d時細胞內(nèi)Aβ免疫陽性信號有所減弱,細胞外出現(xiàn)少量Aβ免疫陽性信號；7 d時Aβ免疫陽性細胞數(shù)量明顯減少,細胞內(nèi)Aβ免疫陽性信號也進一步減弱,但細胞外Aβ免疫陽性信號明顯增加；28 d時Aβ免疫陽性信號以細胞內(nèi)為主,細胞外幾乎消失。在同側(cè)丘腦:MCAO術(shù)后2 d未見Aβ免疫陽性信號,3 d時出現(xiàn)少量表達,7 d時表達量明顯增加,

16、而且一直持續(xù)至28 d。
　　 2.2 Aβ免疫陽性信號空間分布特點:在梗死灶周邊:MCAO術(shù)后2 d免疫熒光雙標示Aβ主要分布于神經(jīng)元內(nèi)；3 d至21 d時Aβ在神經(jīng)元內(nèi)和細胞外均有分布；28 d時Aβ主要分布于星型膠質(zhì)細胞內(nèi)。在同側(cè)丘腦:Aβ均分布于VPN區(qū),除了在MCAO術(shù)后28 d時有少量Aβ分布于小膠質(zhì)細胞內(nèi)之外其余均分布于細胞外。
　　 2.3 Aβ免疫陽性信號形態(tài)學特點:在梗死灶周邊細胞外的Aβ形狀一直呈細

17、小顆粒狀；而在同側(cè)丘腦7 d內(nèi)也呈細小顆粒狀,至21 d時部分仍呈細小顆粒狀,但部分聚集成小斑塊狀,28 d時以斑塊狀為主,且斑塊直徑比21 d明顯增大。
　　 二、第二部分結(jié)果
　　 1、血壓
　　 RHRSP術(shù)后12 w大鼠血壓(193.25±9.82 mmHg)明顯高于RHRSP術(shù)前1w的基礎(chǔ)血壓(103.45±11.99 mmHg,P<0.01)。MCAO術(shù)前1 d和MCAO術(shù)后7 d,假手術(shù)組、MCAO

18、組、溶劑對照組和DAPT組之間血壓均無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。
　　 2、神經(jīng)功能評價
　　 MCAO術(shù)前假手術(shù)組、MCAO組、溶劑對照組和DAPT組大鼠雙側(cè)前肢粘貼物平均移除時間均無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)；MCAO術(shù)后7 d,MCAO組、溶劑對照組和DAPT組大鼠右前肢粘貼物平均移除時間均比假手術(shù)組明顯延長(分別為:30.3±3.9,27.9±4.4,22.9±4.8,6.4±1.6 s,P均<0.01),

19、但DAPT組明顯比溶劑對照組更短(P<0.05)。四組大鼠左前肢粘貼物平均移除時間與術(shù)前相比均無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。MCAO術(shù)前四組大鼠提高后軀體擺動實驗發(fā)現(xiàn)向左右偏轉(zhuǎn)的百分比無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)；MCAO術(shù)后7 d,MCAO組、溶劑對照組和DAPT組大鼠向右側(cè)偏轉(zhuǎn)的百分比均明顯比假手術(shù)組高(分別為:90.6±9.8％,87.5±10.7％,81.9±13.3％,53.8±15.1％,P均<0.01),但DAPT組與

20、溶劑對照組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　 3、Nissl染色
　　 MCAO術(shù)后7 d MCAO組、溶劑對照組和DAPT組腦梗死體積占對側(cè)半球的相對百分比分別為15.64±2.15％,14.69±2.08％和13.08±3.20％,三組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。MCAO術(shù)后7 d MCAO組、溶劑對照組和DAPT組同側(cè)丘腦VPN完好神經(jīng)元數(shù)量比假手術(shù)組明顯減少(分別為:40.62±5.09,43.13±

21、4.51,52.98±9.95,71.17±4.54個/400倍視野,P均<0.01),但DAPT組與溶劑對照組相比完好神經(jīng)元數(shù)量明顯增多(P<0.05)。
　　 4、丘腦Aβ、NeuN、OX-42免疫組織化學檢查
　　 假手術(shù)組全腦組織未見Aβ免疫陽性信號。MCAO術(shù)后7 d MCAO組、溶劑對照組和DAPT組同側(cè)丘腦Aβ免疫陽性面積比假手術(shù)組明顯增加,均具有統(tǒng)計學差異(P均<0.001),DAPT組與溶劑對照組相比同

22、側(cè)丘腦Aβ陽性面積降低50.7％(P<0.001)。
　　 MCAO術(shù)后7 d MCAO組、溶劑對照組和DAPT組同側(cè)丘腦VPN NeuN免疫反應(yīng)陽性細胞計數(shù)分別為:37.6±5.2,38.6±4.6,51.1±5.9個/400倍視野,均明顯少于假手術(shù)組(63.3±6.6個/400倍視野,P均<0.01),但DAPT組比溶劑對照組明顯更多(P<0.05)。
　　 MCAO術(shù)后7 d MCAO組、溶劑對照組和DAPT組同側(cè)

23、丘腦VPN OX-42免疫反應(yīng)陽性細胞計數(shù)分別為:79.1±3.3,75.4±5.8,49.7±5.9個/400倍視野,均明顯多于假手術(shù)組(17.6±2.0個/400倍視野,P均<0.01),而且OX-42免疫反應(yīng)陽性細胞體積較大,突觸明顯增多,呈活化狀態(tài),但DAPT組與溶劑對照組相比OX-42免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)量明顯更少(P<0.05)。
　　 5、丘腦Aβx-42酶聯(lián)免疫吸附實驗
　　 MCAO術(shù)后7 d MCAO組

24、、溶劑對照組和DAPT組同側(cè)丘腦Aβx-42水平明顯高于假手術(shù)組(分別為:1017.25±135.15,952.65±154.23,530.73±145.39和22.23±5.65 pg/mg,P均<0.001)。DAPT組與溶劑對照組相比降低了同側(cè)丘腦Aβ x-42量為41.47％(P<0.001)。
　　 6、相關(guān)分析
　　 MCAO術(shù)后7 d MCAO組、溶劑對照組和DAPT這三組缺血大鼠同側(cè)丘腦VPN完好神經(jīng)元數(shù)

25、量(Nissl染色)或NeuN免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)量(NeuN免疫組織化學染色)均與對應(yīng)三組大鼠右前肢粘貼物平均移除時間呈明顯負相關(guān)(r分別為-0.872和-0.891,P均<0.001)。同樣,三組缺血大鼠同側(cè)丘腦VPN完好神經(jīng)元數(shù)量或NeuN免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)量均與對應(yīng)三組大鼠同側(cè)丘腦Aβ免疫陽性面積呈明顯負相關(guān)(r分別為-0.789和-0.755,P均<0.001)。但是,三組缺血大鼠同側(cè)丘腦VPN神經(jīng)元數(shù)量與右前肢運動評分之間無明

26、顯相關(guān)關(guān)系(P均>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、RHRSP大鼠局灶性大腦皮層梗死后梗死周邊和同側(cè)丘腦存在Aβ的動態(tài)表達,其中在梗死周邊表達為一過性,早期表達于神經(jīng)元內(nèi),然后釋放到細胞外,后期被膠質(zhì)細胞吞噬清除；而在同側(cè)丘腦呈持續(xù)性,一直沉積于細胞外;
　　 2、RHRSP大鼠局灶性大腦皮層梗死后Aβ表達在梗死周邊與缺血有關(guān),而在同側(cè)丘腦與直接缺血無關(guān)；
　　 3、局灶性大腦皮層梗死后同側(cè)丘腦Aβ沉