水凝膠培養(yǎng)的原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞感染Ⅱ型登革病毒對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-29的影響.pdf

1、登革病毒（DENV）是一種蟲媒病毒，主要是通過(guò)白紋伊蚊和埃及伊蚊進(jìn)行傳播，每年約有5000萬(wàn)-5.28億人口受到感染。DENV感染可以引起登革熱（DF）和危及生命的登革出血熱（DHF）及登革休克綜合征(DSS)，其中DHF/DSS是重癥的登革病毒感染，其主要的特征之一是血漿滲漏。目前普遍認(rèn)為DHF/DSS的發(fā)病機(jī)制主要包括病毒毒力因素，抗體依賴性感染增強(qiáng)效應(yīng)（ADE），宿主因素，交叉反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病理?yè)p傷以及細(xì)胞因子風(fēng)暴等。眾多

2、發(fā)病機(jī)制的提出主要是因?yàn)槟Ｐ偷牟煌?，目前小鼠、人血管?nèi)皮細(xì)胞主要以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）作為研究DENV感染發(fā)病機(jī)制的主要模型，但小鼠模型的運(yùn)用并不能完全模擬人類的感染情況，細(xì)胞模型則因作用因素單一也不能確切的反映感染癥狀。
　　近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)組織基底硬度是影響細(xì)胞功能的主要因素之一，正常生理?xiàng)l件下血管基底膜及下層基質(zhì)的彈性硬度值影響了多種與血管內(nèi)皮細(xì)胞生存、復(fù)制、遷徙和維持穩(wěn)態(tài)的重要生物學(xué)功能，不同彈性硬度條件下這些生

3、物學(xué)功能水平差異較大。當(dāng)前利用聚丙烯酰胺凝膠構(gòu)建不同的組織硬度可以影響細(xì)胞的生物學(xué)功能，使其能夠更貼近生理環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)水凝膠模擬人血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜彈性硬度，使體外模型的建立能夠更貼近生理環(huán)境，為 DENV發(fā)病機(jī)制的研究提供一個(gè)新的研究模型。
　　目的:利用水凝膠(hydrogel)模擬人類血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜彈性硬度,以登革病毒2型(DENV-2)NGC株感染接種于水凝膠為基底的原代 HUVECs,觀察HUVECs在水凝膠與普

4、通塑料培養(yǎng)瓶產(chǎn)生IL-29的情況。
　　方法:
　　1.原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定：從健康新生兒的臍帶中分離并培養(yǎng)原代HUVECs,利用免疫組織化學(xué)法和流式細(xì)胞術(shù)鑒定所分離的細(xì)胞。
　　2.水凝膠的制備和細(xì)胞接種：將原代 HUVECs接種于丙烯酰胺與聚丙烯酰胺混合配制的水凝膠。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及感染率：以MOI(multiplicity of infection)=10的DENV-2

5、NGC株感染HUVECs,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)48h細(xì)胞的凋亡率及病毒的感染率。
　　4.基因芯片檢測(cè)：提取DENV-2感染48h的接種于水凝膠和普通塑料瓶的原代HUVECs的總mRNA，送檢樣本進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片的檢測(cè)。
　　5.實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)及雙抗體夾心ELISA法實(shí)驗(yàn)：通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR及雙抗體夾心ELISA法驗(yàn)證基因芯片檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:DENV-2 NGC株感染培養(yǎng)于水凝膠的

6、原代 HUVECs48h,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)證實(shí)原代 HUVECs的病毒感染率較低,細(xì)胞凋亡率與水凝膠未感染組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；通過(guò)mRNA基因表達(dá)譜芯片、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL-29的表達(dá)與普通塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶接種的原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞受到病毒感染存在差異。
　　結(jié)論:利用DENV-2 NGC株感染接種于水凝膠的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,通過(guò) mRNA基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL-29的產(chǎn)生,并且與體外正常