HER2基因和mdr1基因高表達(dá)腫瘤細(xì)胞對力達(dá)霉素的藥物敏感性.pdf

1、HER2受體是人類表皮生長因子受體家族四個成員之一，該受體被磷酸化后主要引起MAPK和PI3K/Akt二個下游細(xì)胞信號通路的激活，在細(xì)胞的生長、分化和凋亡等生理活動中發(fā)揮重要作用。HER2在多種腫瘤中都有較高的表達(dá)，HER2高表達(dá)的腫瘤患者預(yù)示著對化療的抗性、較高的惡性程度、較高的復(fù)發(fā)率和較短的生存期。腫瘤患者對化療藥物的敏感性還和腫瘤細(xì)胞HER2是否高表達(dá)有關(guān)系。 腫瘤細(xì)胞多藥抗藥(multidrugresistance，MD

2、R)是腫瘤化療失敗的重要原因，而由mdr1基因編碼的P-gp(P-glycoprotein)蛋白介導(dǎo)的多藥抗藥則是經(jīng)典的多藥抗藥機(jī)制。P-gp作為跨膜蛋白，對天然的疏水性抗腫瘤藥物有較強(qiáng)的外排作用，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降，降低了藥物對腫瘤生長的抑制作用。 力達(dá)霉素(Lidamycin，LDM)是本研究室從一株放線菌(Streptomycesglobisporussp.C-1027)代謝產(chǎn)物中獲得的對腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈殺傷作用的大分子

3、肽類抗腫瘤抗生素。本研究分別構(gòu)建了HER2和mdr1基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)染分別獲得了HER2和mdr1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞株，并用來探討力達(dá)霉素對HER2和mdr1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性。 一、LDM與HER2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞藥物敏感性的關(guān)系本研究構(gòu)建了能在真核細(xì)胞表達(dá)HER2的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/HER2。把該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HER2低表達(dá)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞，獲得了穩(wěn)定高表達(dá)HER2的MCF-7/HER2細(xì)胞，

4、同時獲得了用空白質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的作為對照的細(xì)胞株MCF-7/plasmid細(xì)胞。單克隆MCF-7/HER2細(xì)胞經(jīng)RT-PCR和Westernblot分析表明，HER2的mRNA和蛋白p185HER2表達(dá)水平大約均是MCF-7/plasmid細(xì)胞的50倍。細(xì)胞免疫熒光分析證實(shí)了MCF-7/HER2細(xì)胞p185HER2蛋白高表達(dá)并且分布在細(xì)胞膜上。這些結(jié)果表明，HER2基因已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到MCF-7/HER2細(xì)胞并高表達(dá)，MCF-7細(xì)

5、胞和MCF-7/HER2細(xì)胞可以作為分子靶點(diǎn)HER2的細(xì)胞模型進(jìn)行藥物敏感性的研究。 MTT結(jié)果表明，相對于HER2低表達(dá)的MCF-7細(xì)胞，LDM對HER2高表達(dá)的MCF-7/HER2細(xì)胞的生長抑制作用沒有顯著改變，IC50值分別為0.0174±0.0023nM和0.0183±0.0036nM；另外四種細(xì)胞毒藥物ADR、MMC、MTX和5-FU對MCF-7/HER2細(xì)胞的IC50值也沒有發(fā)生顯著性變化；MCF-7/HER2細(xì)胞對

6、Taxol和VCR的敏感性下降，IC50值分別由MCF-7細(xì)胞的0.079±0.031μM和0.040±0.021μM升高到MCF-7/HER2細(xì)胞的0.753±0.174μM和2.03±0.43μM，這表明HER2高表達(dá)細(xì)胞對Taxol和VCR的藥物敏感性降低。 LDM兩個劑量組0.05mg/kg和0.025mg/kg對HER2低表達(dá)和高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7及SKBr-3兩種裸鼠移植性腫瘤的抑制率沒有顯著性差異；Taxo

7、l20mg/kg及10mg/kg兩個劑量組對MCF-7細(xì)胞裸鼠移植性腫瘤的抑制率高于對SKBr-3細(xì)胞移植性腫瘤的抑制率，且有顯著性差異。結(jié)果提示，裸鼠移植性乳腺癌癌細(xì)胞HER2蛋白表達(dá)高低對LDM的抑瘤效果沒有影響，而HER2蛋白表達(dá)增高則會降低Taxol的抑瘤效果。 0.001nM、0.01nM、0.1nM和1.0nM濃度的LDM作用于MCF-7/HER2或SKBr-3細(xì)胞48小時，均引起HER2蛋白、HER2蛋白磷酸化和A

8、kt蛋白磷酸化水平的升高，并呈劑量依賴性；RT-PCR結(jié)果表明HER2mRNA水平也隨LDM濃度的升高而升高。由于LDM對MCF-7和MCF-7/HER2細(xì)胞的生長抑制作用無差異，表明HER2/PI3K/Akt信號通路在LDM抑制細(xì)胞生長過程中未起到作用或未起到主要作用。0.1nMLDM作用MCF-7/HER2細(xì)胞6小時后，HER2的蛋白水平達(dá)到最高，12小時、24小時和48小時HER2的蛋白水平與6小時的蛋白水平一致。0.01nM、1

9、.0nM、10nM和100nMLDM的輔基蛋白作用MCF-7/HER2細(xì)胞48小時沒有引起HER2蛋白水平的改變，表明HER2相關(guān)蛋白的改變是由LDM的烯二炔發(fā)色團(tuán)引起的。0.01μM、0.1μM和1.0μMTaxol作用于MCF-7/HER2細(xì)胞48小時，HER2蛋白、HER2蛋白磷酸化和Akt蛋白磷酸化水平均沒有變化，表明Taxol對HER2/PI3K/Akt信號通路無影響。 我們用HER2反義寡核苷酸降低細(xì)胞的HER2表達(dá)

10、水平后檢測癌細(xì)胞對LDM的敏感性是否改變。0.5μMHER2反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide，AS-ODN)作用SKBr-3細(xì)胞48小時可以抑制HER2的蛋白表達(dá)，隨著AS-ODN的濃度升高HER2的蛋白表達(dá)水平逐漸降低，呈劑量依賴關(guān)系。與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的IC50值相比較，盡管細(xì)胞經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染AS-ODN后HER2蛋白水平下降，LDM對經(jīng)1.0μMAS-ODN瞬時轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞和SKBr-3細(xì)胞的

11、IC50值均沒有顯著性改變。本結(jié)果證實(shí)了癌細(xì)胞對LDM的敏感性不受HER2蛋白表達(dá)高低的影響。與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的IC50值相比較，Taxol對經(jīng)1.0μMAS-ODN瞬時轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞IC50值沒發(fā)生顯著性改變；對經(jīng)1.0μMAS-ODN瞬時轉(zhuǎn)染的SKBr-3細(xì)胞的IC50值發(fā)生了顯著性改變，由未轉(zhuǎn)染SKBr-3細(xì)胞的4.21μM降低到經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染SKBr-3細(xì)胞的1.62μM。本結(jié)果證實(shí)了癌細(xì)胞對Taxol的敏感性隨HER2蛋白表達(dá)降

12、低而增高。 Herceptin是抗HER2的人源化單克隆抗體，我們對Herceptin是否改變癌細(xì)胞對LDM的敏感性進(jìn)行了分析。1.0μg/mlHerceptin作用于SKBr-3細(xì)胞48小時可以抑制HER2蛋白的表達(dá)，Herceptin濃度升高抑制作用增強(qiáng)。30μg/mlHerceptin和Taxol聯(lián)合分別作用于MCF-7細(xì)胞和SKBr-3細(xì)胞72小時，Taxol的IC50值較之于Taxol單獨(dú)用藥降低了9.2倍和49.8倍

13、。30μg/mlHerceptin和LDM聯(lián)用分別作用于MCF-7細(xì)胞和SKBr-3細(xì)胞72小時，LDM的IC50值較之于LDM單獨(dú)用藥降低了2.0倍和18.1倍。結(jié)果表明，Herceptin和LDM聯(lián)合作用于MCF-7或SKBr-3細(xì)胞存在加合作用；Herceptin和Taxol聯(lián)合作用于MCF-7或SKBr-3細(xì)胞均存在協(xié)同作用。 二、HER2受體抑制劑的篩選及抗腫瘤活性EMD31是本研究所合成的蒽酮類衍生物，其抗腫瘤活性

14、未見報道。大黃素(eModin)能抑制HER2的蛋白表達(dá)，對HER2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的生長抑制作用。本部分研究以emodin為陽性對照化合物，研究EMD31對HER2高表達(dá)細(xì)胞的生長抑制作用。Westernblot結(jié)果表明30μMemodin和30μMEMD31均能明顯抑制HER2的表達(dá)及其蛋白磷酸化水平，但30μMEMD31的抑制作用低于30μMemodin。MTT結(jié)果顯示，40μMEMD31對MCF-7和MCF-7/HER2細(xì)

15、胞增殖的抑制率分別為20.4％和31.9％，40μMemodin的抑制率則分別為50.8％和56.4％。EMD31對細(xì)胞的抑制作用低于emodin，但對HER2高表達(dá)細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于HER2低表達(dá)細(xì)胞。對于MCF-7細(xì)胞，emodin與Taxol、或與LDM聯(lián)用，EMD31與Taxol、或與LDM聯(lián)用均無協(xié)同抗腫瘤作用；對于MCF-7/HER2細(xì)胞emodin與Taxol、或與LDM聯(lián)用，EMD31與Taxol、或與LDM聯(lián)用均存在協(xié)

16、同抗腫瘤作用。結(jié)果表明EMD31可以作為HER2受體抑制劑，但作用低于emodin；EMD31與化療藥物聯(lián)用對HER2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞有協(xié)同抗腫瘤作用。 Geldanamycin(GDM)是本研究所根據(jù)文獻(xiàn)合成的化合物。GDM和分子伴侶Hsp90結(jié)合導(dǎo)致HER2蛋白表達(dá)被抑制。Westernblot結(jié)果表明50nMGDM明顯抑制HER2的表達(dá)，GDM濃度升高抑制作用增強(qiáng)。GDM對MCF-7、MCF-7/HER2和SKBr-3細(xì)胞

17、的IC50值分別為1.007μM、0.482μM和0.113μM，其生長抑制作用隨HER2表達(dá)升高而增強(qiáng)。50nMGDM與LDM聯(lián)用，對MCF-7細(xì)胞和MCF-7/HER2細(xì)胞均有協(xié)同抗腫瘤作用；10nM或50nMGDM與Taxol聯(lián)用，對MCF-7細(xì)胞和MCF-7/HER2細(xì)胞均有協(xié)同抗腫瘤作用。 三、耐藥基因mdr1高表達(dá)腫瘤細(xì)胞對LDM的藥物敏感性本部分實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR從多藥抗藥乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADR中獲取全長

18、mdr1cDNA，構(gòu)建了mdr1真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/mdr1，通過轉(zhuǎn)染獲得了穩(wěn)定高表達(dá)mdr1的人肝癌HepG2/mdr1細(xì)胞，該細(xì)胞具有P-gp蛋白外排藥物的活性，可作為篩選抗mdr1藥物的細(xì)胞模型。MTT法結(jié)果顯示，相對于HepG2細(xì)胞，具有多藥抗藥性的HepG2/mdr1細(xì)胞對LDM的敏感性沒有變化，IC50值分別為0.015nM和0.020nM；而Taxol、ADR、CDDP和5-FU的IC50值分別提高了40.3倍、