RNAi抑制Mx1基因表達(dá)對腫瘤VSV溶瘤敏感性的促進(jìn)作用.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：RNAi抑制Mx1基因表達(dá)對腫瘤VSV溶瘤敏感性的促進(jìn)作用
　　 目的:實(shí)驗(yàn)研究5種腫瘤細(xì)胞系對于水泡性口膜炎病毒(VSV)溶瘤效應(yīng)的敏感性；實(shí)驗(yàn)闡明Ⅰ類干擾素下游的抗病毒蛋白-鼠黏病毒蛋白1(Mx1)基因的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞對VSV病毒敏感性的相關(guān)性；應(yīng)用RNAi干擾技術(shù)抑制Mx1基因的表達(dá)水平來提高水泡性口膜炎病毒溶瘤的敏感性。
　　 方法:首先將本實(shí)驗(yàn)室保種的VSV病毒在

2、BHK細(xì)胞系上進(jìn)行擴(kuò)增并通過空斑實(shí)驗(yàn)進(jìn)行病毒定量,將定量后的病毒保種并用來攻擊5種不同種類的腫瘤細(xì)胞系:RAW264.7(小鼠巨噬細(xì)胞白血病),B16(黑色素瘤),Hepal-6(小鼠肝癌),MHCC97-H(人肝癌高轉(zhuǎn)移株),SMMC7721(人肝癌),48h后通過TCID50法和MTT法檢測5種腫瘤細(xì)胞系對VSV病毒的敏感性；挑選其中三種鼠源的腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行RT-PCR檢測Ⅰ類干擾素下游的Mx1基因的基礎(chǔ)表達(dá)水平,外源加入Ⅰ類干擾素

3、后Mx1基因的誘導(dǎo)表達(dá)水平以及VSV攻擊三種腫瘤細(xì)胞株24h后Mx1基因的誘導(dǎo)表達(dá)水平從而證實(shí)腫瘤細(xì)胞系的溶瘤敏感性與Mx1基因表達(dá)的相關(guān)性；應(yīng)用RNAi干擾技術(shù)抑制Mx1基因的表達(dá)水平,鏡下觀察聯(lián)合MTT法檢測RAW264.7細(xì)胞系(最不敏感細(xì)胞系)與B16細(xì)胞系(最敏感細(xì)胞系)溶瘤效果的改變。
　　 結(jié)果:VSV病毒的定量為9.5×106 pfu/ml。用VSV病毒攻擊5種腫瘤細(xì)胞系呈現(xiàn)出的敏感性依次為B16>HEPA1-6

4、>MHCC97-H>SMMC7721>RAW264.7。通過RT-PCR檢測Ⅰ類干擾素下游Mx1基因的基礎(chǔ)表達(dá)水平,外源Ⅰ類干擾素誘導(dǎo)Mx1基因的表達(dá)水平以及VSV病毒攻擊三種鼠源腫瘤細(xì)胞系24小時后Mx1基因的誘導(dǎo)表達(dá)水平顯示出Mx1基因的表達(dá)水平越高,腫瘤細(xì)胞對VSV病毒的敏感性越低,進(jìn)而證實(shí)在腫瘤細(xì)胞中Ⅰ類干擾素通路的活性與VSV病毒的溶瘤效果密切相關(guān)。同時應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制RAW264.7細(xì)胞系(最不敏感細(xì)胞系)Mx1基因的表

5、達(dá),該細(xì)胞系對VSV病毒溶瘤的敏感性提高了35％。最后,為了證實(shí)這種基因治療的方法具有廣泛的適用性并且為了安全性盡量少的應(yīng)用病毒,我們應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制B16細(xì)胞系(最敏感細(xì)胞系)Mx1基因的表達(dá),再用低劑量VSV病毒攻擊該細(xì)胞系,該細(xì)胞系對VSV病毒溶瘤的敏感性提高了30％。證明通過RNAi基因治療技術(shù),可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞系Ⅰ類干擾素下游的抗病毒蛋白Mx1的表達(dá)水平,從而增強(qiáng)腫瘤對溶瘤病毒的敏感性,促進(jìn)病毒的溶瘤作用,為病毒的溶

6、瘤治療提供了一條新的途徑。
　　 結(jié)論:不同的腫瘤細(xì)胞對VSV病毒溶瘤的敏感性不同；腫瘤細(xì)胞對VSV病毒溶瘤的敏感性與腫瘤細(xì)胞Ⅰ類干擾素通路下游的主要抗病毒蛋白Mx1的表達(dá)水平相關(guān)；應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制Mx1基因的表達(dá)水平可以顯著地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對VSV溶瘤的敏感性。
　　 第二部分：利用熒光標(biāo)記抗MxA單克隆抗體早期特異性檢測兒童白血病伴發(fā)病毒感染
　　 目的:利用熒光標(biāo)記抗人黏病毒蛋白A(MxA)單克隆抗體和流

7、式細(xì)胞術(shù)早期特異性檢測兒童白血病伴發(fā)的病毒感染。
　　 方法:熒光標(biāo)記抗MxA單克隆抗體,檢測其特異性；采集臨床發(fā)熱和不發(fā)熱的白血病兒童外周血標(biāo)本,分離外周血單個核細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)染色,并用流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果。
　　 結(jié)果:熒光染料直接標(biāo)記MxA單克隆抗體具有較高的特異性；白血病兒童外周血單核細(xì)胞MxA表達(dá)水平與其臨床病毒感染直接相關(guān),并且檢出MxA高表達(dá)較臨床確診病毒感染早7d；沒有發(fā)熱和臨床確診為細(xì)菌感染的病例均無檢測到