達(dá)托霉素產(chǎn)生菌的菌種選育及發(fā)酵工藝研究.pdf

1、達(dá)托霉素(Daptomycin)是一類新型的環(huán)脂肽類抗生素，由玫瑰孢鏈霉菌發(fā)酵得到。它具有獨(dú)特的作用機(jī)制，能殺死絕大多數(shù)的革蘭氏陽性菌，對耐藥菌也有很強(qiáng)的活性。本論文對達(dá)托霉素產(chǎn)生菌的菌種選育及發(fā)酵工藝進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，以期獲得高產(chǎn)的菌株及適宜的發(fā)酵工藝。
　　第一部分:達(dá)托霉素產(chǎn)生菌的菌種選育
　　菌種選育在抗生素生產(chǎn)中具有重要的作用。選擇適宜的方法可以提高篩選的效率，降低工作的強(qiáng)度。
　　目的:對本實(shí)驗(yàn)室自主分離的

2、野生型達(dá)托霉素產(chǎn)生菌進(jìn)行不同方法的誘變處理，篩選達(dá)托霉素的高產(chǎn)菌株。
　　方法:選擇誘變成功率較高的方法對本實(shí)驗(yàn)室自主分離的野生型達(dá)托霉素產(chǎn)生菌進(jìn)行誘變處理，篩選達(dá)托霉素的高產(chǎn)菌株。選擇的方法有:紫外誘變、化學(xué)誘變、原生質(zhì)體紫外誘變、癸酸抗性篩選。甘油管保藏篩選得到的高產(chǎn)菌株。
　　結(jié)果:紫外誘變處理野生型達(dá)托霉素產(chǎn)生菌D-0，篩選得到達(dá)托霉素的高產(chǎn)突變株D-146，其達(dá)托霉素產(chǎn)量達(dá)到62.8mg/L，與出發(fā)菌株D-0相比達(dá)

3、托霉素產(chǎn)量提高了121.1％。
　　亞硝基胍NTG誘變處理達(dá)托霉素的高產(chǎn)菌株D-146，篩選得到達(dá)托霉素的高產(chǎn)突變株D-336，其達(dá)托霉素產(chǎn)量達(dá)到131.3mg/L，與出發(fā)菌株D-146相比達(dá)托霉素產(chǎn)量提高了109.1％。
　　原生質(zhì)體紫外誘變處理達(dá)托霉素的高產(chǎn)菌株D-336，篩選得到達(dá)托霉素的高產(chǎn)突變株D-406，其達(dá)托霉素產(chǎn)量達(dá)到325.2mg/L，與出發(fā)菌株D-336相比達(dá)托霉素產(chǎn)量提高了147.7％。
　　癸酸

4、抗性誘變處理達(dá)托霉素的高產(chǎn)菌株D-406，篩選得到達(dá)托霉素的高產(chǎn)突變株D-699，其達(dá)托霉素產(chǎn)量達(dá)到428.1mg/L，與出發(fā)菌株D-406相比達(dá)托霉素產(chǎn)量提高了31.64％。
　　第二部分:達(dá)托霉素產(chǎn)生菌的發(fā)酵工藝研究
　　特定的菌株有其最適宜的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，優(yōu)化溫度、pH、溶氧等培養(yǎng)條件能使菌株得到最佳的生長環(huán)境，從而生產(chǎn)出更多的目標(biāo)產(chǎn)物。
　　目的:考察不同發(fā)酵條件對達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株的搖瓶發(fā)酵的影響，確定達(dá)托

5、霉素?fù)u瓶發(fā)酵的最佳發(fā)酵工藝;在20L發(fā)酵罐驗(yàn)證搖瓶最佳發(fā)酵工藝放大培養(yǎng)的可行性。
　　方法:考察斜面培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、前體添加濃度、種齡、發(fā)酵培養(yǎng)時間等因素對高產(chǎn)突變株D-699發(fā)酵的影響;采用均勻設(shè)計法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基。將優(yōu)化的發(fā)酵工藝在搖瓶和20L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，比較搖瓶和20L發(fā)酵罐發(fā)酵后的達(dá)托霉素產(chǎn)量。
　　結(jié)果:達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株D-406的最佳培養(yǎng)條件為:斜面培養(yǎng)時間10天、發(fā)酵溫度2

6、8℃、搖床轉(zhuǎn)速220 rpm/min、種子培養(yǎng)基初始pH值7.5、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值7.0-7.5、接種量0.5％、種齡30小時、發(fā)酵時間5天、最適癸酸添加濃度0.4％。
　　達(dá)托霉素發(fā)酵培養(yǎng)的最適碳氮源分別為葡萄糖、可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨;采用均勻設(shè)計優(yōu)化培養(yǎng)基成分的組成，最優(yōu)的碳氮源配比為葡萄糖∶可溶性淀粉∶酵母粉∶蛋白胨為1.2∶1∶1∶2。
　　搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化后的達(dá)托霉素產(chǎn)量達(dá)到533.7mg/L，比優(yōu)化前提

7、高了24.67％。
　　20L發(fā)酵罐發(fā)酵達(dá)托霉素的最適攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm/min、流加癸酸時癸酸的最適添加濃度為0.5％。搖瓶優(yōu)化的發(fā)酵工藝在20L發(fā)酵罐進(jìn)行放大驗(yàn)證，達(dá)托霉素的產(chǎn)量為586.4mg/L比搖瓶結(jié)果提高了9.87％。
　　結(jié)論:本論文采用多種誘變成功率較高的誘變方法處理野生型達(dá)托霉素產(chǎn)生菌D-0，篩選得到了達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株D-699，搖瓶發(fā)酵單位達(dá)到428.1mg/L，比原始菌株D-0提高了約15倍，D-6