達托霉素產(chǎn)生菌的菌種選育及發(fā)酵工藝研究.pdf

1、達托霉素(Daptomycin)是一類新型的環(huán)脂肽類抗生素，由玫瑰孢鏈霉菌發(fā)酵得到。它具有獨特的作用機制，能殺死絕大多數(shù)的革蘭氏陽性菌，對耐藥菌也有很強的活性。本論文對達托霉素產(chǎn)生菌的菌種選育及發(fā)酵工藝進行了系統(tǒng)的研究，以期獲得高產(chǎn)的菌株及適宜的發(fā)酵工藝。
　　第一部分:達托霉素產(chǎn)生菌的菌種選育
　　菌種選育在抗生素生產(chǎn)中具有重要的作用。選擇適宜的方法可以提高篩選的效率，降低工作的強度。
　　目的:對本實驗室自主分離的

2、野生型達托霉素產(chǎn)生菌進行不同方法的誘變處理，篩選達托霉素的高產(chǎn)菌株。
　　方法:選擇誘變成功率較高的方法對本實驗室自主分離的野生型達托霉素產(chǎn)生菌進行誘變處理，篩選達托霉素的高產(chǎn)菌株。選擇的方法有:紫外誘變、化學誘變、原生質(zhì)體紫外誘變、癸酸抗性篩選。甘油管保藏篩選得到的高產(chǎn)菌株。
　　結(jié)果:紫外誘變處理野生型達托霉素產(chǎn)生菌D-0，篩選得到達托霉素的高產(chǎn)突變株D-146，其達托霉素產(chǎn)量達到62.8mg/L，與出發(fā)菌株D-0相比達

3、托霉素產(chǎn)量提高了121.1％。
　　亞硝基胍NTG誘變處理達托霉素的高產(chǎn)菌株D-146，篩選得到達托霉素的高產(chǎn)突變株D-336，其達托霉素產(chǎn)量達到131.3mg/L，與出發(fā)菌株D-146相比達托霉素產(chǎn)量提高了109.1％。
　　原生質(zhì)體紫外誘變處理達托霉素的高產(chǎn)菌株D-336，篩選得到達托霉素的高產(chǎn)突變株D-406，其達托霉素產(chǎn)量達到325.2mg/L，與出發(fā)菌株D-336相比達托霉素產(chǎn)量提高了147.7％。
　　癸酸

4、抗性誘變處理達托霉素的高產(chǎn)菌株D-406，篩選得到達托霉素的高產(chǎn)突變株D-699，其達托霉素產(chǎn)量達到428.1mg/L，與出發(fā)菌株D-406相比達托霉素產(chǎn)量提高了31.64％。
　　第二部分:達托霉素產(chǎn)生菌的發(fā)酵工藝研究
　　特定的菌株有其最適宜的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，優(yōu)化溫度、pH、溶氧等培養(yǎng)條件能使菌株得到最佳的生長環(huán)境，從而生產(chǎn)出更多的目標產(chǎn)物。
　　目的:考察不同發(fā)酵條件對達托霉素高產(chǎn)菌株的搖瓶發(fā)酵的影響，確定達托

5、霉素搖瓶發(fā)酵的最佳發(fā)酵工藝;在20L發(fā)酵罐驗證搖瓶最佳發(fā)酵工藝放大培養(yǎng)的可行性。
　　方法:考察斜面培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、前體添加濃度、種齡、發(fā)酵培養(yǎng)時間等因素對高產(chǎn)突變株D-699發(fā)酵的影響;采用均勻設計法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基。將優(yōu)化的發(fā)酵工藝在搖瓶和20L發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，比較搖瓶和20L發(fā)酵罐發(fā)酵后的達托霉素產(chǎn)量。
　　結(jié)果:達托霉素高產(chǎn)菌株D-406的最佳培養(yǎng)條件為:斜面培養(yǎng)時間10天、發(fā)酵溫度2

6、8℃、搖床轉(zhuǎn)速220 rpm/min、種子培養(yǎng)基初始pH值7.5、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值7.0-7.5、接種量0.5％、種齡30小時、發(fā)酵時間5天、最適癸酸添加濃度0.4％。
　　達托霉素發(fā)酵培養(yǎng)的最適碳氮源分別為葡萄糖、可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨;采用均勻設計優(yōu)化培養(yǎng)基成分的組成，最優(yōu)的碳氮源配比為葡萄糖∶可溶性淀粉∶酵母粉∶蛋白胨為1.2∶1∶1∶2。
　　搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化后的達托霉素產(chǎn)量達到533.7mg/L，比優(yōu)化前提

7、高了24.67％。
　　20L發(fā)酵罐發(fā)酵達托霉素的最適攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm/min、流加癸酸時癸酸的最適添加濃度為0.5％。搖瓶優(yōu)化的發(fā)酵工藝在20L發(fā)酵罐進行放大驗證，達托霉素的產(chǎn)量為586.4mg/L比搖瓶結(jié)果提高了9.87％。
　　結(jié)論:本論文采用多種誘變成功率較高的誘變方法處理野生型達托霉素產(chǎn)生菌D-0，篩選得到了達托霉素高產(chǎn)菌株D-699，搖瓶發(fā)酵單位達到428.1mg/L，比原始菌株D-0提高了約15倍，D-6