AML1a在小鼠造血細(xì)胞增殖分化異常及惡性轉(zhuǎn)化中的作用及全反式維甲酸處理NB4細(xì)胞的微小RNA表達(dá)譜分析.pdf

1、細(xì)胞的增殖分化受到嚴(yán)格調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)細(xì)胞中多種基因的表達(dá)是其中重要的調(diào)控機(jī)制。造血細(xì)胞的增殖失控、分化能力的喪失將可能導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及白血病的發(fā)生。因此，闡明轉(zhuǎn)錄因子的功能對(duì)于確定細(xì)胞增殖分化調(diào)控機(jī)制以及在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用具有重要意義。AML1也稱之為PEBP2αB、CBFα2或RUNX1，是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。它在造血細(xì)胞中普遍表達(dá)，調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的分化和增殖。 RUNX1/AML1通過選擇性剪接產(chǎn)生至少三種異構(gòu)

2、體：AML1a、AML1b和AML1c。其中，AML1b與AML1c僅在氨基末端存在27個(gè)氨基酸殘基的差異，均具有兩個(gè)主要的功能結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，兩者的功能基本相同，即我們通常所說的AML1。AML1a具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但缺少轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，因此通常被認(rèn)為不具有轉(zhuǎn)錄激活功能，但由于其具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可以與AML1b/1c競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶基因的DNA結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致靶基因不能正常轉(zhuǎn)錄，提示AML1a可能干擾AML

3、1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。有證據(jù)表明，AML1a在急性髓系白血病(AML)中表達(dá)高于正常對(duì)照。我們的前期實(shí)驗(yàn)也已證實(shí)AML1a在急性白血病(AL)中的高表達(dá)，而且，AML1a可以抑制由AML1b介導(dǎo)的M-CSF受體(M-CSFR)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，提示AML1a對(duì)AML1b具有拮抗作用。有學(xué)者認(rèn)為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的缺失可能引起白血病的發(fā)生，但目前尚無此方面的報(bào)道。為了進(jìn)一步研究AML1a在造血及白血病發(fā)病中的作用并探討其作用機(jī)制，本文完成了下列研究工作：

4、 1.AML1a表達(dá)載體的構(gòu)建及病毒的制備 pMSCV-FLAG-AML1a-IRES-YFP質(zhì)粒，將此質(zhì)粒和pMSCV-IRES-YFP分別與輔助質(zhì)粒pVPack-Eco(含Env)、pVPack-GP(含gal-pol)組合，通過磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，制備逆轉(zhuǎn)錄病毒。病毒感染3T3細(xì)胞，檢測(cè)病毒滴度，并測(cè)定AML1a的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在感染的細(xì)胞中證實(shí)有AML1a和YFP的表達(dá)，所制備的病毒滴度滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)

5、的要求。 2.AML1a在小鼠造血細(xì)胞增殖分化異常及惡性轉(zhuǎn)化中的作用 1)C57雄性小鼠的骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)AML1a及空白對(duì)照后，置于含mSCF、mIL-3、mIL-6的IMDM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，分別于感染后11天、23天和35天通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)確定各系表面標(biāo)志的變化，結(jié)果顯示感染AML1a的BMMNC中Sea-1及Thy1.2的表達(dá)均較對(duì)照組升高，提示AML1a可能將造血干細(xì)胞的分化阻滯

6、于較為早期的淋巴細(xì)胞階段。 2)將轉(zhuǎn)導(dǎo)AML1a的C57小鼠的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，尾靜脈注射至致死劑量照射的C57雌性小鼠體內(nèi)，單一轉(zhuǎn)導(dǎo)YFP的小鼠作為對(duì)照。定期尾靜脈取血，查血象及白細(xì)胞分類。血象有異常改變后，處死小鼠，觀察有無肝、脾、淋巴結(jié)腫大，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表型變化。轉(zhuǎn)導(dǎo)AML1a的12只C57小鼠中，有9只在移植后3-11個(gè)月相繼死亡，解剖可見肝脾腫大，可伴有胸腺瘤和淋巴結(jié)腫大。病理可見骨髓、脾、肺、腎、胸腺或淋巴結(jié)可見

7、大量白血病細(xì)胞浸潤(rùn)。流式分析顯示白血病細(xì)胞主要有兩個(gè)表型：Sca-1+cCD3+和CD3+CD4+CD8+，提示均為T-淋巴細(xì)胞白血病。發(fā)病小鼠脾細(xì)胞接種同類小鼠可再次發(fā)生表型相同的T-淋巴細(xì)胞白血病。以上結(jié)果表明AML1a在白血病的發(fā)生中發(fā)揮重要的作用，并且可能具備導(dǎo)致白血病的能力。 3)將AML1a發(fā)病小鼠脾細(xì)胞傳代后取第二代發(fā)病鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期測(cè)定。與對(duì)照組相比，發(fā)病小鼠骨髓中G0/G1細(xì)胞比例增高，S期細(xì)胞比例明

8、顯降低，提示AML1a將小鼠骨髓細(xì)胞阻滯于G0/G1期。此結(jié)果說明AML1a基因可能通過抑制細(xì)胞自G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)換，改變正常細(xì)胞增殖分裂的進(jìn)程，導(dǎo)致造血細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。 綜上所述，本研究通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)AML1a至小鼠BMMNC中，并將其移植到致死劑量照射的小鼠體內(nèi)，首次證實(shí)了AML1a的可以引起造血細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化并導(dǎo)致白血病發(fā)生。初步推測(cè)AML1a可能在白血病特別是淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)病中起重要作用。此外，我們的實(shí)驗(yàn)也為