全反式維甲酸、亞砷酸對白血病NB4細胞CD-,44-變異體表達的影響.pdf

1、目的：急性早幼粒細胞白血病是急性髓細胞白血病的一個亞型，APL出現(xiàn)特異的染色體和基因改變，這是APL發(fā)病及應用全反式維甲酸和亞砷酸治療有效的分子基礎，其療效已得到國內外的公認。
　　 研究采用ATRA、As2O3作用于人APL細胞株NB4細胞，通過光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)、MTT法觀察細胞生長抑制狀況、流式細胞術檢測細胞分化及凋亡、并應用RQ-PCR法檢測ATRA、As2O3作用前后NB4細胞CD44v3、CD44v6及CD44v

2、10及PML/RARα mRNA表達水平的變化。旨在探討誘導APL細胞分化或凋亡過程中不同CD44v分子和PML/RARα表達的變化，及二者的相互關系，為CD44v作為白血病診斷、療效判斷及預后指標提供理論依據(jù)。
　　 方法：體外培養(yǎng)人APL細胞株NB4細胞，分別用ATRA、As2O3、ATRA+As2O3進行干預，應用MTT比色法檢測細胞生長；用流式細胞術分析以上藥物對細胞分化的影響；AnnexinV-FITC/PI雙標法檢測

3、上述藥物對NB4細胞凋亡的影響；應用RQ-PCR法檢測細胞中PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10 mRNA的表達水平變化。所得結果運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包處理。
　　 結果：1.ATRA、As2O3作用下NB4細胞的形態(tài)學改變：NB4細胞株具有急性早幼粒白血病細胞的典型形態(tài)，胞漿充滿顆粒，核膜略凹陷，有空泡。Wright’s-Giemsa染色光鏡下觀察：經ATRA作用后NB4細胞體積變小、核漿比例縮

4、小、染色質變粗糙、核仁消失；核形態(tài)不規(guī)則，呈腎形、桿狀及分葉核。As2O3作用于NB4細胞后表現(xiàn)為細胞體積縮小，細胞膜完整，胞漿中出現(xiàn)空泡，核染色質濃縮、碎裂成塊彌散在胞漿中，并可見膜結構包裹的凋亡小體。
　　 2.ATRA、As2O3對NB4細胞的增殖抑制作用：統(tǒng)計學分析顯示，ATRA、As2O3及二者聯(lián)用對NB4細胞均有增殖抑制作用，隨時間延長，生長抑制率明顯增加，各個時間點間比較，除ATRA組24h與48h之間無統(tǒng)計學差異

5、之外，其他時間點間差異均有統(tǒng)計學意義；同一時間點，各個處理組之間比較，24h各處理組之間無統(tǒng)計學差異，48h與96h各處理組之間均有統(tǒng)計學差異，生長抑制率As2O3+ATRA組大于As2O3組，大于ATRA組；72h As2O3+ATRA大于As2O3組和ATRA組，而As2O3組和ATRA組之間無統(tǒng)計學差異。
　　 3.ATRA、As2O3、ATRA+As2O3對NB4細胞表面CD11b抗原表達的影響：ATRA作用于NB4細胞

6、48h、72h、96h后，CD11b抗原表達分別為(32.47±2.95)[％]、(84.93±1.45)[％]、(90.9±0.35)[％]；As2O3作用于NB4細胞48h、72h、96h后，CD11b抗原表達分別為(10.97±1.33)[％]、(15.7±0.87)[％]、(18.9±0.30)[％]；ATRA+As2O3作用于NB4細胞48h、72h、96h后，CD11b抗原表達分別為(18.57±0.65)[％]、(21.1

7、7±0.65)[％]、(26.53±0.83)[％]。統(tǒng)計學分析顯示：各個處理組隨時間延長，CD11b表達逐漸增多，各個時間點之間有顯著性差異；同一時間點，各處理組間比較，CD11b的表達ATRA組大于ATRA+As2O3組，大于As2O3組，均高于空白對照組，有統(tǒng)計學差異。
　　 4.As2O3、ATRA+As2O3對NB4細胞凋亡的影響：ATRA作用于NB4細胞24h、48h、72h、96h后早期凋亡率分別為(0.57±0.

8、06)[％]、(0.90±0.20)[％]、(1.07±0.35)[％]、(1.20±0.30)[％]；As2O3作用于NB4細胞24h、48h、72h、96h后早期凋亡率分別為(9.53±0.59)[％]、(13.77±0.70)[％]、(18.27±0.35)[％]、(16.23±1.15)[％]；ATRA+As2O3作用于NB4細胞24h、48h、72h、96h后早期凋亡率分別為(2.27±0.32)[％]、(3.93±0.25)

9、[％]、(7.83±0.40)[％]、(9.00±0.75)[％]。經單因素方差分析，在對照組中4個時間點測得的早期、中晚期和總凋亡率無統(tǒng)計學差異，說明自然凋亡對本實驗研究的其他統(tǒng)計結果沒有影響。各個時間點ATRA組與對照組早期凋亡率無統(tǒng)計學差異，24h～72h ATRA組與對照組中晚期凋亡率無統(tǒng)計學差異，96h差異有統(tǒng)計學意義。As2O3作用24h細胞早期凋亡率較高，而在As2O3作用48h以后細胞以中晚期凋亡為主。24h、48h、7

10、2h As2O3處理的NB4細胞隨時間延長，早期凋亡率、中晚期凋亡率及總凋亡率均明顯增高，呈時間依賴性，96h較72h早期凋亡率降低，總凋亡率無統(tǒng)計學差異。各個時間點As2O3組凋亡率均高于其他各組，有統(tǒng)計學差異。
　　 5.ATRA、As2O3、ATRA+As2O3對NB4細胞PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10 mRNA表達水平的影響：RQ-PCR檢測結果顯示，以各組各指標空白對照組RQ值為1，ATR

11、A作用于NB4細胞48h、72h、96h后PML/RARα的RQ值分別為：0.4867±0.0040、0.2380±0.0056、0.2137±0.0061；CD44v3的RQ值分別為：0.6437±0.0042、0.6263±0.0047、0.4020±0.0030；CD44v6的RQ值分別為：0.8370±0.0040、0.5417±0.0040、0.4263±0.0051；CD44v10的RQ值分別為：0.4940±0.0026、

12、0.3780±0.0030、0.2643±0.0067；As2O3作用于NB4細胞48h、72h、96h后PML/RARα的RQ值分別為：0.3180±0.0027、0.3030±0.0040、0.2863±0.0047；CD44v3的RQ值分別為：0.6527±0.0045、0.4957±0.0057、0.2223±0.0035；CD44v6的RQ值分別為：0.5817±0.0047、0.5343±0.0042、0.4617±0.00

13、38；CD44v10的RQ值分別為：0.5263±0.0045、0.2490±0.0036、0.3347±0.0040；ATRA+As2O3作用于NB4細胞48h、72h、96h后PML/RARα的RQ值分別為：0.6983±0.0025、0.2717±0.0035、0.1910±0.0036；CD44v3的RQ值分別為：0.4543±0.0047、0.4127±0.0040、0.1980±0.0070；CD44v6的RQ值分別為：0.

14、5027±0.0040、0.3230±0.0020、0.2787±0.0020；CD44v10的RQ值分別為：0.4657±0.0035、0.4260±0.0598、0.1487±0.0035；統(tǒng)計學分析顯示：除ATRA+As2O3組48h與72h之間CD44v10的表達無統(tǒng)計學差異外，各處理組隨時間延長上述各指標的表達均呈遞減趨勢，且各時間點之間有統(tǒng)計學差異。同一時間點，不同處理組之間上述各個指標下降趨勢經統(tǒng)計學分析得出：除72h經A

15、TRA和ATRA+As2O3作用前后CD44v10的變化無統(tǒng)計學差異外，其他各組均可得出各個時間點的PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10的mRNA表達經ATRA+As2O3作用后下降最明顯，差異有統(tǒng)計學意義。經繪制散點圖并應用直線相關分析得出：經ATRA、As2O3、ATRA+As2O3作用前后，隨時間延長，PML/RARα與CD44v6的變化趨勢均呈正相關，相關系數(shù)分別為r=0.98、r=0.951、r=0.9

16、99；As2O3作用前后，隨時間延長，PML/RARα與CD44v3的變化趨勢呈正相關，r=0.965，其他各組之間無直線相關關系。
　　 結論：1.ATRA、As2O3及二者聯(lián)用對NB4細胞具有增殖抑制作用，隨時間延長，生長抑制率明顯增加；同一時間點，各個處理組之間比較，48h、72h和96h As2O3+ATRA組生長抑制率均高于As2O3組和ATRA組。
　　 2.ATRA、As2O3、ATRA+As2O3可誘導N

17、B4細胞表面CD11b的表達增加，且隨作用時間延長表達逐漸增加；同一時間點，各處理組間比較，ATRA組處理的NB4細胞CD11b的表達明顯高于ATRA+As2O3組和As2O3組。
　　 3.As2O3、ATRA+As2O3可誘導NB4細胞凋亡。隨時間延長，凋亡細胞數(shù)增多，呈時間依賴性。As2O3作用24h細胞早期凋亡率較高，48h以后細胞以中晚期凋亡為主。各個時間點不同處理組之間As2O3處理的NB4細胞早期凋亡率、中晚期凋亡

18、率及總凋亡率均明顯高于其他各組。
　　 4.ATRA、As2O3、ATRA+As2O3可使NB4細胞PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10 mRNA的表達下降，呈時間依賴性。ATRA+As2O3作用于NB4細胞后各時間點的PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10的mRNA表達下降明顯高于其他處理組。經ATRA、As2O3、ATRA+As2O3作用后，隨時間延長，PML/RARα與CD44