Axin在全反式維甲酸抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及促凋亡作用中的機制研究.pdf

1、研究背景：維甲酸類化合物(retinoids)是一類維生素A衍生物，包括維甲酸（retinoicacidRA）、維胺酸（retinamide）、維胺酯（retimidester）和天然維生素A（retinol）等。維生酸A對生命活動必不可少，它對胚胎發(fā)育、精子發(fā)生、視覺和細(xì)胞分化都有十分重要的作用。早期研究表明維生素A缺乏的動物易發(fā)生腫瘤。在飲食中加入藥理學(xué)濃度的維生素能減少化學(xué)藥物誘發(fā)腫瘤的發(fā)生率。維甲酸類化合物最引人注目的作用是預(yù)防

2、及治療一些惡性腫瘤，包括白血病、乳腺癌、皮膚癌、宮頸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等。給予RA或合成維甲酸類似物導(dǎo)致人的多種腫瘤細(xì)胞株或腫瘤異種移植物生長停止、凋亡和分化。全反式維甲酸屬于第三代維甲酸，該維甲酸類化合物由于多烯肽側(cè)鏈的改變及羧基方向不同分為兩種異構(gòu)體，即順式維甲酸（cis-retinoicacidcisRA）及全反式維甲酸(all-transretinoicacidATRA)，其中全反式構(gòu)型最為穩(wěn)定和常見。RA及其衍生物主要通過其

3、經(jīng)典的核受體信號通路（RARs和RXRs）從三個方面發(fā)揮抗腫瘤作用：誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，生長抑制和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。大量的研究表明，RA介導(dǎo)的核受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與Wnt/beta-canetin等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間存在著的相互作用（talkcross），共同調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖及凋亡。
　　Axin（Axisinhibition）是1997年發(fā)現(xiàn)的小鼠Fused基因的編碼產(chǎn)物，它是Wnt信號通路的重要的構(gòu)架蛋白，它將進入細(xì)胞的信號整

4、合并傳給下游的效應(yīng)分子，從而實現(xiàn)相應(yīng)的生物學(xué)功能。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)Axin至少通過Wnt、、JNK、TGF-β及p53等信號通路中發(fā)揮重要作用。其生物學(xué)功能涉及胚胎發(fā)育、糖原代謝、腫瘤形成、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等方面。特別是近年來，Axin作為腫瘤抑制因子，引起人們廣泛的興趣。Axin過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠中出現(xiàn)不同組織器官大量細(xì)胞死亡，腺病毒轉(zhuǎn)染野生型Axin基因到腫瘤細(xì)胞，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。我們實驗室以往研究證實野生型小鼠Axin基因

5、的過表達可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。近期研究表明Axin參與全反式維甲酸（all-transretinoicacidATRA）促胚胎癌細(xì)胞株分化的調(diào)節(jié)，提示Axin可能是維甲酸類化合物調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡的一個重要的調(diào)節(jié)分子。
　　膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤（約占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的42％），其中四分之三是惡性腫瘤。大量的臨床及實驗研究表明RA可以有效地降低膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)率，提高患者的生存率。明確Axin在

6、ATRA調(diào)控膠質(zhì)瘤的增殖、凋亡中的作用，將有助于我們進一步探討膠質(zhì)瘤的發(fā)病機理并為其生物學(xué)治療提供依據(jù)。
　　目的：探討Axin基因是否參與ATRA介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的增殖、凋亡及其作用機制。
　　方法：（1）治療量的ATRA處理膠質(zhì)瘤C6、U251細(xì)胞株，采用MTT比色法繪制細(xì)胞生長曲線、平板克隆形成實驗對細(xì)胞克隆形成能力進行了檢測、BrdUrd摻入實驗檢測細(xì)胞的增殖能力、流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞增殖、凋亡狀態(tài)的變化。（2）應(yīng)用

7、免疫熒光檢測β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的定位、RT-PCR及Westernblot方法分別檢測Axin、p53、β-catenin的mRNA及其蛋白質(zhì)的表達的變化。（3）膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法瞬時轉(zhuǎn)染rAxin，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡的變化；采用免疫熒光染色定位β-catenin、RT-PCR及Westernblot方法分別檢測穩(wěn)/瞬轉(zhuǎn)C6細(xì)胞株細(xì)胞中Axin、p53、β-catenin的mRNA及其蛋白質(zhì)的表達的變化，研究

8、過表達Axin是否類似ATRA對細(xì)胞的作用。（4）AxinRNAi片斷轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡的變化，RT-PCR及Westernblot方法分別檢測p53等的mRNA及其蛋白質(zhì)的表達的變化。探討AxinRNAi能否逆轉(zhuǎn)ATRA對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的調(diào)節(jié)。
　　結(jié)果：（1）ATRA抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、促進其凋亡；ATRA激活A(yù)xin、p53的表達、穩(wěn)定胞漿內(nèi)β-catenin蛋白的表達而不影響其總蛋白量。（2）膠質(zhì)瘤C

9、6細(xì)胞過表達Axin與ATRA的作用類似：（i）抑制細(xì)胞增殖，促其凋亡；（ii）穩(wěn)定胞漿β-catenin蛋白的表達；（iii）激活p53的表達。（3）AxinRNAi逆轉(zhuǎn)ATRA對膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的抑制作用：促進細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡并抑制p53的表達。
　　結(jié)論：Axin參與ATRA介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制及促凋亡作用；ATRA激活的Axin的表達，上調(diào)抑癌基因p53的表達，并促進β-catenin的核漿穿梭，增加胞漿內(nèi)β-c