人生長分化因子5的克隆、表達(dá)和誘導(dǎo)活性的初步研究.pdf

1、生長分化因子5(Growth differentiation factor 5,GDF5)是TGF-β超家族(Transforming growth factor-β supeffamily TGF-β)骨形態(tài)發(fā)生蛋白亞家族(bone morphogenetic proteins subfamily BMPs)較特殊的一員,優(yōu)勢表達(dá)于關(guān)節(jié)軟骨組織,它在軟骨發(fā)生和長骨發(fā)育中具有重要作用,可促進(jìn)體外培養(yǎng)間質(zhì)祖細(xì)胞的軟骨和骨生成活性,體內(nèi)移植

2、研究表明GDF5能異位誘導(dǎo)生成軟骨和骨組織,而且主要誘導(dǎo)軟骨樣組織.為了進(jìn)一步了解GDF5的生物學(xué)活性以及拓展其在骨和軟骨組織工程中的應(yīng)用,特進(jìn)行了該實(shí)驗(yàn).該研究從人胎兒軟骨組織中提取總RNA,利用RT-PCR的方法分別克隆了GDF5完整成熟肽和全長cDNA序列,并分別把兩個序列克隆入原核表達(dá)載體pET22b(+)和真核表達(dá)載體pEGFP-C2,構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體pET22b(+)-GDF5和重組真核表達(dá)載體pEGFP-C2-GDF

3、5.原核重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21(DE3)后用IPTG進(jìn)行成熟肽的誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳檢測表達(dá)蛋白的誘導(dǎo)動力學(xué),Western bloting鑒定表達(dá)蛋白.凝膠介質(zhì)鎳離子螯合法純化目的蛋白,植入小鼠后肢股部肌袋內(nèi)進(jìn)行表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性鑒定.同時分離培養(yǎng)人胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs),流式細(xì)胞儀鑒定MSCs表面抗原.LipofectAMINE脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染重組子pEGFP-C