DADS通過MEK1-ERK1-2-ELK1信號途徑抑制HepG2細胞apo(a)表達.pdf

1、人類血漿中的高脂蛋白(a)[Lipoprotein(a)，LP(a)]水平是動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素。大量研究證實血漿中高LP(a)水平是動脈粥樣硬化的一個獨立危險因素。LP(a)是一種特殊的獨立地脂蛋白,1963年由挪威科學家Berg首次發(fā)現(xiàn)并命名。LP(a)主要由低密度脂蛋白樣脂質(zhì)核心、載脂蛋白B100和特異性分子載脂蛋白(a)組成。目前臨床研究中，還無有效的方法下調(diào)患者血漿中的脂蛋白(a)水平。載脂蛋白(a)是脂蛋白(a)

2、的特有組成部分，研究表明apo(a)具有纖溶酶原的相似結(jié)構(gòu)，它包含了10個串聯(lián)重復(fù)的kringle的結(jié)構(gòu)序列(KIV1-10)和一個無活性的蛋白酶結(jié)構(gòu)域。apo(a)通過KIV9結(jié)構(gòu)域中的一個半胱氨酸殘基形成二硫鍵與LDL樣外部的apoB100相連。所以研究如何下調(diào)apo(a)在機體內(nèi)表達，可以成為目前降低血漿中脂蛋白(a)的策略根據(jù)。大量研究表明在 apo(a)基因啟動子-1630/-1615bp的區(qū)域存在 Est-1轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點，E

3、st-1位點可以被激活的轉(zhuǎn)錄因子Elk-1結(jié)合而抑制apo(a)基因的轉(zhuǎn)錄，從而下調(diào)apo(a)的表達。Elk1可以被它的上游因子 ERK1/2磷酸化而激活；同樣地ERK1/2的上游因子 MEK1可以磷酸化激活 ERK1/2的磷酸化。二烯丙基二硫(diallyl disulfide DADS)是從大蒜素分離出來的一種脂溶性物質(zhì)。DADS對心血管疾病的保護作用最近幾年被許多科學家進行了大量地研究。有研究證實大蒜素可以降低小鼠、家兔、雞等體

4、內(nèi)膽固醇脂的蓄積。也有研究表明大蒜素也可以降低人體內(nèi)的 LDL-C和總膽固醇。同時，有文獻證實DADS可以激活MEK1的磷酸化而激活ERK1/2-ELK-1的信號途徑。因此，本論文研究 DADS對 HepG2細胞 apo(a)表達的影響，并探討 DADS的作用機制，為研究下調(diào)血漿脂蛋白(a)的藥物提供新的思路和干預(yù)靶點。
　　第一部分：DADS對HepG2細胞apo(a)表達的影響
　　目的：觀察DADS對HepG2細胞ap

5、o(a)表達的影響。
　　方法：HepG2細胞培養(yǎng)用含10％胎牛血清高糖培養(yǎng)基，待細胞濃度達到80%用不同濃度DADS（0μg/mL，10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL,80μg/mL）的新鮮無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；接著用40μg/mL DADS處理HepG2細胞不同時間（0、6h、12h、24h、48h）；分別用RT-PCR與Western blot檢測apo(a)的蛋白mRNA表達水平與蛋白表達水平，用ELISA法

6、測定apo(a)的分泌水平。
　　結(jié)果：與對照組相比 HepG2細胞內(nèi)的apo(a)的mRNA與蛋白表達水平以及分泌水平分別呈DADS濃度依賴性下降，而且隨著DADS處理時間的增加，HepG2細胞的apo(a)的mRNA與蛋白表達水平以及分泌水平分別呈時間依賴性下降，處理24h作用最為明顯。
　　小結(jié)：DADS呈劑量依賴性及時間依賴性下調(diào) HepG2細胞中 apo(a) mRNA和蛋白的表達及其分泌水平。
　　第二部分

7、：DADS下調(diào)HepG2細胞apo(a)表達的機制
　　目的：探討研究DADS降低HepG2細胞apo(a)表達的分子機制。
　　方法：HepG2細胞用無血清高糖培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，然后分別用MEK1, ERK1/2信號的抑制劑PD184325, PD98059與Elk-1siRNA處理HepG2細胞，隨后加入40μg/mL DADS處理細胞24h。分別用Western blot檢測HepG2細胞的MEK1, p-MEK1, E

8、RK1/2、p-ERK1/2、Elk1、p-ERK1/2、apo(a)表達，RT-PCR檢測HepG2細胞中的apo(a) mRNA表達變化，用 ELISA法檢測 apo(a)分泌水平變化。用免疫熒光檢測Elk1的核轉(zhuǎn)位水平變化。
　　結(jié)果：DADS顯著上調(diào) p-MEK1、p-ERK1/2及 p-ELK1表達；抑制MEK1、ERK1/2可以減弱DADS對HepG2細胞中apo(a)表達的下調(diào)作用；同時干擾ELK1也可以觀察到相似的