下調(diào)CENP-E基因表達(dá)對(duì)泛素蛋白酶抑制劑lactacystin誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡影響.pdf

1、一、RNA干擾技術(shù)對(duì)PC12細(xì)胞CENP-E基因表達(dá)影響觀察
　　1、目的：建立干擾CENP-E基因表達(dá)的質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，觀察CENP-E的表達(dá)。
　　2、方法：人工合成PShRNA-CENP-E質(zhì)粒1、2、3，將3種質(zhì)粒，與對(duì)照組空載體質(zhì)粒以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法共同轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后用熒光顯微鏡評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染的效率。然后用Western bloting、免疫組化評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)CENP-E表達(dá)變化。
　　3、

2、結(jié)果：成功合成的3種 PShRNA-CENP-E質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染 PC12細(xì)胞的成功率約為72.5％，Western Bloting和免疫組化示：質(zhì)粒3轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)CENP-E的表達(dá)水平下降。
　　4、結(jié)論：PShRNA-CENP-E質(zhì)粒3能特異性降低PC12細(xì)胞中CENP-E表達(dá)。
　　二、NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)元樣分化及l(fā)actacystin誘導(dǎo)下建立帕金森細(xì)胞模型
　　1、目的：誘導(dǎo) PC12長出突觸呈神經(jīng)元樣化

3、，觀察不同濃度 lactacystin誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡情況，選擇最適合濃度構(gòu)建PD細(xì)胞模型。
　　2、方法：培養(yǎng) PC12細(xì)胞，傳代后，加入終濃度為50μg/L的神經(jīng)生長因子（NGF）培養(yǎng)24小時(shí)，按終濃度為0、5、10、20、30μM加入lactacystin，MTT測細(xì)胞活力，HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)。將細(xì)胞分3組：對(duì)照組、雙蒸水組、能使細(xì)胞活力明顯下降的lactacystin最小濃度組，培養(yǎng)24小時(shí)，進(jìn)行α-突觸核蛋白免疫組

4、化染色。
　　3、結(jié)果：加入NGF細(xì)胞24小時(shí)后，長出突觸，呈神經(jīng)元樣分化，MTT顯示活力結(jié)果:10μM，20μM，30μM組活力明顯較對(duì)照組下降（P<0.05），HE染色示：對(duì)照組、0μM，5μM細(xì)胞突觸較長，胞體完整，10μM，20μM,30μM細(xì)胞密度降低，突觸減少或斷裂，呈凋亡樣改變。10μM lactacystin處理細(xì)胞出現(xiàn)α-突觸核蛋白陽性細(xì)胞。
　　4、結(jié)論：濃度為50μg/L的NGF能誘導(dǎo) PC12細(xì)胞神經(jīng)

5、元樣分化，lactacystin能誘導(dǎo)其凋亡。濃度為10μM lactacystin能明顯誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞產(chǎn)生α-突觸核蛋白，可用于構(gòu)建PD細(xì)胞模型。
　　三、下調(diào)CENP-E基因表達(dá)對(duì)泛素蛋白酶抑制劑lactacystin誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡影響
　　1、目的：探討下調(diào)著絲粒蛋白 E（CENP-E）基因表達(dá)是否能影響泛素蛋白酶抑制劑 lactacystin誘導(dǎo) PC12細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)其他酶的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)為深研

6、究PD的發(fā)病機(jī)制提供理論根據(jù)。
　　2、方法：人工合成下調(diào)CENP-E的PshRNA-CENP-E質(zhì)粒，采用體外培養(yǎng)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤（adrenochromaffino，PC12）細(xì)胞株，共分6組，待細(xì)胞生長良好時(shí)，加入神經(jīng)生長因子（NGF）培養(yǎng)24小時(shí)，按分組，對(duì)照組（A）換新鮮培養(yǎng)液；空載體轉(zhuǎn)染組（B）；下調(diào)載體轉(zhuǎn)染組（C）；lactacystin誘導(dǎo)細(xì)胞24小時(shí)的PD細(xì)胞模型組（D）；空載體轉(zhuǎn)染PD細(xì)胞模型組（E）；下調(diào)

7、載體轉(zhuǎn)染PD細(xì)胞模型組（F）。對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行 MTT測細(xì)胞存活率，TUNEL檢測細(xì)胞凋亡，HE染色顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，Western blot測著酪氨羥化酶（TH）及乙酰膽堿酯酶（AchE）表達(dá)，免疫組化測細(xì)胞內(nèi) CENP-E、α-觸核蛋白、TH、AchE表達(dá)變化。
　　3、結(jié)果：
　　1、MTT檢查顯示：C、D、E、F組與對(duì)照組相比細(xì)胞活力都有明顯降低（P<0.05）。
　　2、TUNEL凋亡檢測：C、D、E、F組

8、凋亡陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增多（P<0.05）。
　　3、HE染色顯示C、D、E、F組均出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)。
　　4、免疫組化示：轉(zhuǎn)染下調(diào)載體的C組 CENP-E陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組減少（P<0.05），加入lactacystin，能引起 CENP-E表達(dá)降低（P<0.05）。α-突觸核蛋白免疫組化示：A、B、C組間α-突觸核蛋白比較無差異，加入lactacystin的D、E、F組α-突觸核蛋白較前三組明顯增

9、多（P<0.05），但三組間比較無明顯差異（P>0.05）。
　　5、Western bolt證實(shí)單純下調(diào) CENP-E后，酪氨酸羥化酶（TH）、乙酰膽堿酯（AchE）表達(dá)不受影響，但加入lactacystin后，轉(zhuǎn)入下調(diào)載體的細(xì)胞 TH、AchE表達(dá)下降，TH、AchE免疫組化提示相同結(jié)果。
　　4、結(jié)論：
　　1、PD細(xì)胞模型中 CENP-E表達(dá)較正常對(duì)照組下降。
　　2、下調(diào)CENP-E表達(dá)可降低正常PC1