柑桔葉片干旱脅迫抑制差減cDNA文庫的構(gòu)建與初步分析.pdf

1、在各種自然災(zāi)害中，旱災(zāi)居于首位。在世界范圍內(nèi)，干旱缺水對農(nóng)業(yè)和社會造成的損失相當(dāng)于其他自然災(zāi)害之和。柑桔是世界上產(chǎn)量最大的水果，干旱是柑桔增產(chǎn)的主要限制因子之一。利用分子生物學(xué)方法研究柑桔在水分脅迫條件下的應(yīng)答機(jī)制，進(jìn)而研究其抗旱機(jī)理，對于全面認(rèn)識抗旱性的遺傳基礎(chǔ)，培育抗旱新品種，研發(fā)抗旱栽培技術(shù)，具有重要意義。 本研究以柑桔椪柑(Citrus．reticulata)為實驗材料，構(gòu)建干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)基因的抑制差減雜交(Suppr

2、ession Subtractive Hybridization，SSH)cDNA文庫，通過對文庫的篩選、克隆測序和功能分析，了解柑桔干旱應(yīng)答機(jī)制，為發(fā)掘和利用抗旱相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。 用盆栽興春椪柑自然干旱脅迫作為處理組(Tester)，正常澆水作為對照組(Drivet)，用本實驗室改進(jìn)的苯酚/氯仿/SDS法分別提取上述兩種材料的總RNA，分離純化，獲得高質(zhì)量mRNA各約4μg。采用SSH試劑盒法進(jìn)行抑制差減雜交，首先將上述兩種

3、材料mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，然后進(jìn)行Rsal酶切，之后將Tester酶切產(chǎn)物分成2份：1份與Adoptorl連接，另1份與Adoptor2R連接，最后進(jìn)行抑制差減雜交；將抑制差減雜交第二次PCR的產(chǎn)物純化后連接至pTZ57R/T載體中，轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、培養(yǎng)，獲得具有438個重組克隆的SSH文庫。 將克隆進(jìn)行菌液PCR檢測，得到陽性克隆386個。隨機(jī)送樣測序85個，獲得質(zhì)量較好EST序列78條，

4、其中不重復(fù)EST 62條，序列同源性比較結(jié)果為90％以上的EST可以在GenBank里找到同源性較高的cDNA，其中80％以上的cDNA源于植物在病原菌誘導(dǎo)、干旱、水分、熱擊、冷害、鹽害等生物或非生物脅迫下特異表達(dá)的cDNA文庫。在可以找到同源性的EST中，有的在好幾個文庫中出現(xiàn)，這說明植物所受的各種逆境脅迫都直接或間接影響植物體的水分代謝，各種抗逆反應(yīng)可能存在某些共同的機(jī)制。功能比較分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)有已知功能的EST 51條，根據(jù)這些ES

5、T所代表的基因的功能可分為8類：代謝、轉(zhuǎn)錄、防御、光合作用、蛋白合成、信號傳導(dǎo)、能量、未知功能。其中有28個基因與干旱脅迫關(guān)系密切，對它們進(jìn)行了分析討論。柑桔的干旱脅迫應(yīng)答過程涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因的表達(dá)調(diào)控、物質(zhì)的合成、防御反應(yīng)、、活性氧清除和保護(hù)光合系統(tǒng)等多種途徑。獲得與抗干旱脅迫密切相關(guān)的鈣依賴蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子，脫水素DHN6，、超氧化物歧化酶、NADP--蘋果酸酶、熱擊蛋白、肌醇-1-磷酸合成酶等重要基因的EST。這些EST基本上