人乳頭瘤病毒L1基因在酵母體外翻譯系統(tǒng)和原代角質(zhì)細胞中的表達研究.pdf

1、為進一步闡明L1基因表達的分子調(diào)控機制，我們利用不同分化階段的小鼠和人的原代角質(zhì)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和角質(zhì)細胞體外翻譯系統(tǒng)，研究野生型和優(yōu)化型的HPV6bL1基因隨細胞分化的不同轉(zhuǎn)錄和翻譯特點，試圖進一步解析影響L1蛋白在角質(zhì)細胞中表達的分子調(diào)控機制。一、HPV58L1 mRNA在優(yōu)化的酵母體外翻譯系統(tǒng)中的表達研究研究中首先以含有HPV58全基因組的質(zhì)粒pLink322-HPV58為模板，PCR法擴增HPV58全長型L1基因(LL1)和截短型L

2、1基因(SL1)并連接到真核表達載體pcDNA3.0上，構(gòu)建出真核重組質(zhì)粒pcDNA3/LL1、pcDNA3/SL1，經(jīng)酶切和測序鑒定序列無誤。進而利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒將pcDNA3/LL1、pcDNA3/SL1中的L1基因體外轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的長短L1 mRNA備用。 為構(gòu)建酵母體外翻譯系統(tǒng)，我們首先制備了酵母的原生質(zhì)體，然后根據(jù)以往報道方法制備啤酒酵母細胞的裂解物，并對制備過程進行了調(diào)整和改良。考慮到裂解緩沖液中的鎂離子，鉀離子濃度

3、會影響外源性mRNA翻譯活性，我們針對HPV58L1 mRNA在酵母體外翻譯系統(tǒng)中的翻譯條件需求對鎂離子和鉀離子濃度進行了優(yōu)化。為檢測蔗糖對酵母裂解物穩(wěn)定性的影響，我們在裂解物的制備過程中分別加入不同濃度的蔗糖，并檢測其對系統(tǒng)的保護作用。為確定系統(tǒng)優(yōu)化后翻譯效率的提高程度，檢測了優(yōu)化前后酵母系統(tǒng)對HPV58SL1的翻譯效率，并比較了與商品化的兔網(wǎng)織紅細胞體外翻譯系統(tǒng)(RRL)的翻譯效率的差異，已知劑量的HPV6bL1蛋白作為信號強度對照

4、。 結(jié)果顯示，我們構(gòu)建的體外翻譯系統(tǒng)對HPV58L1 mRNA翻譯活性良好。鎂離子和鉀離子對L1蛋白翻譯的影響顯著，鎂離子在裂解緩沖液中濃度為2.2mM時系統(tǒng)翻譯活性最高，鉀離子的最佳濃度為220mM。加入蔗糖后裂解物的抗凍融能力都有較大的提高，蔗糖的最佳濃度為100mM。對酵母體外翻譯系統(tǒng)進行優(yōu)化后，HPV58SL1 mRNA的翻譯效率比RRL系統(tǒng)高出2倍。經(jīng)計算，優(yōu)化前1μg SL1mRNA在1毫升反應(yīng)液中蛋白的產(chǎn)量為20-

5、40μg，優(yōu)化后為50-70μg，產(chǎn)量提高了1倍。 為進一步研究HPV58長短L1 mRNA在該系統(tǒng)中的翻譯特點和差異，我們在優(yōu)化的酵母體外翻譯系統(tǒng)中加入HPV58全長和截短型L1 mRNA，分別進行體外翻譯反應(yīng)。反應(yīng)過程中改變反應(yīng)時間、L1 mRNA模板量，加入外源性氨基酸或亮氨酸和酵母的氨基酰tRNA等，觀察其對長短L1蛋白合成的影響。結(jié)果顯示HPV58長短L1 mRNA均可以在酵母系統(tǒng)中獲得良好的表達。對比兩者的翻譯模式，

6、截短型L1翻譯啟動迅速，10分鐘內(nèi)即達最高表達量；全長型L1翻譯啟動較慢，反應(yīng)30分鐘后表達量與截短型持平。提示全長型L1蛋白的翻譯依賴于反應(yīng)時間，而截短型L1則不明顯。隨初始mRNA模板量的增高，兩種L1蛋白信號均明顯增強，但截短型L1 mRNA翻譯水平仍明顯高于全長型L1mRNA。外源性的氨基酸的加入僅可以顯著提高全長型L1蛋白的翻譯，而對截短型L1蛋白的翻譯沒有影響，提示內(nèi)源性的氨基酸無法滿足全長L1蛋白合成的需要。加入外源性酵母

7、aa-tRNA對兩種L1蛋白的翻譯均無明顯影響，提示系統(tǒng)中內(nèi)源性的tRNA可充分滿足HPV58兩種L1 mRNA的表達。 為進一步揭示長短L1蛋白合成效率的差異原因，我們在反應(yīng)系統(tǒng)中加入不同濃度的外源性的亮氨酸，觀察其對兩種L1蛋白合成的影響。為檢測體外合成的L1蛋白是否可以組成VLP顆粒，將體外翻譯的反應(yīng)液直接進行蔗糖超速離心后透射電鏡檢測VLP顆粒的形成。Western Blot結(jié)果顯示，亮氨酸可以提高全長型的L1mRNA的

8、翻譯水平，且效應(yīng)呈亮氨酸劑量依賴性；而截短型L1翻譯不受影響。實驗結(jié)果表明，系統(tǒng)中亮氨酸的缺乏是限制HPV58全長型L1表達的重要因素，這是由于長L1蛋白起始序列中亮氨酸的高頻率使用所導(dǎo)致。電鏡結(jié)果顯示全長和截短型L1蛋白均可以組裝成VLP顆粒。 綜上所述，本部分中我們成功地構(gòu)建了一種新型的適合HPV58L1蛋白合成的酵母無細胞翻譯系統(tǒng)。通過對HPV58L1蛋白合成所需的各成分濃度進行優(yōu)化，顯著提高了系統(tǒng)對L1 mRNA的翻譯效

9、率，經(jīng)優(yōu)化后首次觀察到了系統(tǒng)中HPV58VLP的形成。因而該系統(tǒng)成為繼RRL系統(tǒng)后的第二個可進行HPV L1病毒樣顆粒組裝的體外翻譯系統(tǒng)。我們進一步利用該系統(tǒng)探索并揭示了導(dǎo)致長短L1 mRNA翻譯差異的原因，并首次觀察到了HPV58長短L1蛋白組裝的VLP顆粒。HPV/酵母體外翻譯系統(tǒng)具有的開放性和高度可操作性等獨特優(yōu)勢，因而該系統(tǒng)有望用于1)研究HPV 58 L1蛋白在酵母中表達的影響因素，為提高L1蛋白表達產(chǎn)量、完善VLP酵母基因工

10、程疫苗的生產(chǎn)、開發(fā)提供重要的借鑒；2)探討HPV VLP組裝的分子機制，為提高酵母中VLP形成效率，減少其與天然病毒顆粒的免疫原性差異等研究提供一個方便快捷的工具； 3)研究HPVDNA包裝的分子機制，為今后探討長短L1蛋白包裝的病毒顆粒的感染力和感染機制的差異以及抗病毒新靶點的篩選等研究提供良好的平臺。目前，研究成果已申請國家發(fā)明專利一項(公示期)。同類研究尚未見報道。二、HPV6b L1基因在原代角質(zhì)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達研究為了檢測

11、基因密碼組成對L1基因在持續(xù)分化的角質(zhì)細胞中表達的影響，我們用HPV6b野生型和優(yōu)化型的L1真核表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染培養(yǎng)一天的鼠角質(zhì)細胞。轉(zhuǎn)染后的D3，D6，D9，D12分別收集鼠角質(zhì)細胞提取RNA和蛋白。對細胞固定后進行免疫熒光染色后鏡下觀察。實時熒光定量PCR檢測提取的RNA樣品中L1基因的轉(zhuǎn)錄水平。Western Blot方法檢測L1蛋白的合成情況。 鏡下顯示：隨著轉(zhuǎn)染時間的增長，細胞顯示出明顯的逐步增強的細胞分化特征，免疫熒

12、光染色結(jié)果也顯示，角質(zhì)細胞終末分化的標志性蛋白外皮蛋白(involucrin)在細胞內(nèi)的表達也隨轉(zhuǎn)染時間的延長而明顯增強。 實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后角質(zhì)細胞可以持續(xù)轉(zhuǎn)錄野生和優(yōu)化型的L1 mRNA至少12天，而且優(yōu)化型的L1 mRNA的水平始終顯著高于野生型L1，這表明對GC結(jié)尾的密碼子進行優(yōu)化可以促進L1基因在KC細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。隨著細胞的分化，野生型和優(yōu)化型的L1基因的轉(zhuǎn)錄水平都顯著下降。Western Blot分析

13、顯示，野生型L1蛋白的表達隨著細胞轉(zhuǎn)染時間的延長而增強；優(yōu)化型L1蛋白水平隨著細胞轉(zhuǎn)染時間的延長而降低。這表明L1 mRNA的密碼子成分組成是調(diào)節(jié)L1蛋白在KC細胞內(nèi)持續(xù)表達的一個重要因素；HPV L1蛋白的表達是轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)，同時與細胞的分化水平顯著相關(guān)。 甲硫氨酸標記的L1蛋白免疫共沉淀實驗顯示，檢測到的L1蛋白的持續(xù)表達是由于L1蛋白的持續(xù)合成，Ll mRNA的密碼子組成是決定L1蛋白持續(xù)性合成的重要因素。考慮到人角質(zhì)細

14、胞是HPV感染的天然宿主細胞，我們檢測了HPV6b L1真核表達質(zhì)粒在原代人角質(zhì)細胞內(nèi)的表達情況。所得結(jié)果與鼠角質(zhì)細胞中的結(jié)果相似。 為了進一步證實tRNA對L1的翻譯調(diào)控作用，我們檢測了不同分化程度的人或鼠KC中分離的aa-tRNA對體外翻譯系統(tǒng)中L1蛋白翻譯的影響。結(jié)果表明，野生型L1 mRNA傾向于在分化的鼠KC細胞制備的裂解物中進行翻譯，而優(yōu)化型L1mRNA傾向于在低級分化的鼠KC細胞制備的裂解物中進行翻譯。這一結(jié)果與L

15、1轉(zhuǎn)染的KC細胞中觀察到的野生和優(yōu)化L1蛋白的表達模式相同。這表明低級分化和完全分化的角質(zhì)細胞中的aa-tRNA組成不同，因而可以不同程度的吻合HPV野生和優(yōu)化型的L1 mRNA翻譯的需要，從而可以調(diào)節(jié)它們在體外的翻譯水平。綜上所述，本研究中我們首次利用不同分化階段的人和鼠原代角質(zhì)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和體外翻譯系統(tǒng)進行了L1蛋白翻譯調(diào)控機制的研究。研究中首次探索了瞬時轉(zhuǎn)染后的角質(zhì)細胞中L1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯時限，揭示了同義密碼子的替換效應(yīng)與細胞分