AL-CS-DNA與OVA-PLGA-GC納米載體用于鼻腔粘膜免疫的研究.pdf

1、外來(lái)病源微生物（如細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)等）入侵機(jī)體粘膜可造成呼吸道、消化道或全身性的疾病。粘膜免疫是在病原微生物入侵部位誘導(dǎo)局部長(zhǎng)期免疫記憶的最有效方法，它是機(jī)體阻止病原微生物入侵的第一道防線。在粘膜免疫的幾種途徑中，鼻腔粘膜途徑最具非常大的潛力，它不僅可以誘導(dǎo)鼻腔局部免疫還能誘導(dǎo)遠(yuǎn)端粘膜部位的免疫反應(yīng)。納米載體是一種屬于納米級(jí)微觀范疇的亞微粒藥物載體輸送系統(tǒng)。納米載體的特點(diǎn)使其成為優(yōu)良的粘膜疫苗佐劑。第一，納米載體能夠控制抗原的釋放，使

2、抗原在粘膜部位停留時(shí)間大大增長(zhǎng)；第二，納米載體能夠整合其抗原遞呈的功能和其他的效應(yīng)，如免疫調(diào)節(jié)和免疫刺激作用；第三，納米載體能夠克服粘膜生理屏障，有效地增加抗原到達(dá)免疫系統(tǒng)的數(shù)量。
　　本文根據(jù)DNA疫苗和蛋白質(zhì)疫苗的特點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)了兩種納米載體來(lái)提高疫苗的免疫應(yīng)答效果。所使用的疫苗為針對(duì)齲病致病菌（變形鏈球菌）的DNA疫苗，以及蛋白模型疫苗OVA（卵清蛋白）。首先，由于各種生理屏障的存在，防齲DNA疫苗 pGJA-P/VAX單獨(dú)

3、作為粘膜疫苗使用時(shí)，免疫保護(hù)效果有待改進(jìn)。通過(guò)將陰離子脂質(zhì)體（AL）引入殼聚糖（CS）納米載體，設(shè)計(jì)了一種新的DNA疫苗粘膜免疫載體AL/CS/DNA。它能夠?qū)NA疫苗運(yùn)送至鼻腔粘膜層中，具有增強(qiáng)抗原在上皮細(xì)胞內(nèi)吞的功能。TEM的結(jié)果顯示AL/CS/DNA是一種球形結(jié)構(gòu)，它具有很高的包封率，而且能夠抵抗核酸酶的降解從而保護(hù)DNA疫苗結(jié)構(gòu)和功能上的完整性。AL/CS/DNA的表面電荷具有強(qiáng)烈的pH環(huán)境依賴性，造成了DNA釋放由環(huán)境pH介

4、導(dǎo)。和傳統(tǒng)的CS/DNA復(fù)合物相比，AL/CS/DNA擁有更高的轉(zhuǎn)染效率和更長(zhǎng)的鼻腔停留時(shí)間。這些特性使得AL/CS/DNA能夠顯著誘導(dǎo)更高水平的IgA（p<0.01）以及長(zhǎng)效粘膜免疫力，提示AL/CS/DNA是一種非常有潛力的DNA疫苗粘膜給藥載體。
　　其次，聚乳酸羥基乙酸（PLGA）納米囊是一種有潛力的蛋白質(zhì)疫苗載體，用于粘膜免疫時(shí)能夠顯著增強(qiáng)免疫應(yīng)答，同時(shí)具有良好的生物降解性和生物相容性。然而PLGA納米囊惰性的、負(fù)電荷表

5、面限制了其與負(fù)電荷細(xì)胞膜之間的相互作用，一定程度上限制了細(xì)胞對(duì)它的攝取。本研究采用乙二醇?xì)ぞ厶牵℅C）對(duì)PLGA納米囊表面進(jìn)行修飾，來(lái)增強(qiáng)其粘膜免疫應(yīng)答的效果。GC的作用主要體現(xiàn)在幾個(gè)方面：一是增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC細(xì)胞）對(duì)納米囊的內(nèi)吞；二是可以與溶酶體相互作用來(lái)促進(jìn)納米囊從溶酶體中逃逸；三是延長(zhǎng)抗原在鼻腔粘膜的停留時(shí)間。這些優(yōu)勢(shì)使得OVA/PLGA/GC（OPG）納米囊能夠誘導(dǎo)有效的粘膜免疫應(yīng)答、系統(tǒng)性免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。本研究完成

6、的主要工作有：
　　(1)利用自組裝的方法制備了AL/CS/DNA復(fù)合物。通過(guò)體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)N/P比為7、lipid/DNA比為3時(shí)可以得到較高的轉(zhuǎn)染效率。所得的AL/CS/DNA復(fù)合物納米粒為球形，結(jié)構(gòu)規(guī)整。
　　(2)凝膠阻滯法和圓二色譜法證實(shí)了AL/CS/DNA復(fù)合物能夠有效地壓縮DNA，但不影響DNA的B型構(gòu)象。同時(shí)AL/CS/DNA復(fù)合物對(duì)環(huán)境pH變化敏感，DNA的釋放具有pH依賴性。
　　(3)體內(nèi)熒

7、光成像法證實(shí)了AL/CS/DNA比CS/DNA具有更長(zhǎng)的鼻腔停留時(shí)間、更好的穿透粘膜層的能力。AL加入并不影響CS/DNA復(fù)合物對(duì)粘液素蛋白吸附能力和打開(kāi)細(xì)胞連接的能力，而是通過(guò)增強(qiáng)上皮細(xì)胞對(duì)AL/CS/DNA的攝取來(lái)延長(zhǎng)復(fù)合物的鼻腔停留時(shí)間。
　　(4)與CS/DNA相比，AL/CS/DNA通過(guò)鼻腔粘膜途徑能夠顯著誘導(dǎo)唾液IgA應(yīng)答，且持續(xù)時(shí)間維持12周以上。AL/CS/DNA能夠同時(shí)在近端粘膜和遠(yuǎn)端粘膜系統(tǒng)產(chǎn)生粘膜應(yīng)答，有潛力

8、作為誘導(dǎo)全身性粘膜免疫應(yīng)答的載體。
　　(5)利用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備了OP（OVA/PLGA）和 OPG（OVA/PLGA/GC）納米囊。制得的OP和OPG納米囊均為球形結(jié)構(gòu)且形態(tài)規(guī)整，OPG有明顯的核殼型結(jié)構(gòu)。
　　(6)細(xì)胞攝取和共定位成像實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GC對(duì)PLGA納米囊的表面修飾可以進(jìn)一步提高DC細(xì)胞對(duì)PLGA納米囊的攝取，而對(duì)PLGA納米粒在細(xì)胞內(nèi)的分布沒(méi)有影響。OP和OPG納米囊兩者都沒(méi)有進(jìn)入到細(xì)胞核中，且兩者都具有

9、從溶酶體中逃逸的能力。
　　(7)體內(nèi)實(shí)時(shí)熒光成像法證實(shí)了GC對(duì)PLGA納米囊的表面修飾可以大大延長(zhǎng)抗原在鼻腔中的停留時(shí)間，一方面是由于細(xì)胞對(duì)兩者攝取的效率不同，更多的OPG進(jìn)入到了細(xì)胞中；二是OP和OPG納米囊的粘附性不同，OPG納米囊在鼻腔粘膜擁有更廣的分布。但是兩者都具有粘膜穿透能力，都進(jìn)入到了粘膜層中，而OVA只是停留于粘膜層外。
　　(8)本研究對(duì)OP和OPG納米囊在誘導(dǎo)粘膜免疫、系統(tǒng)性免疫和細(xì)胞免疫的能力進(jìn)行了評(píng)