家蠶脯氨酰寡肽酶家族的鑒定及BmAPH的體外表達(dá)與活性分析.pdf

1、脯氨酰寡肽酶家族（Prolyl oligopeptidase family）是絲氨酸蛋白酶超家族（Serine protease superfamily）中的一個家族，包括脯氨酰寡肽酶（POP）、二肽基肽酶（DDP）、乙酰肽水解酶（APH）和谷氨酰內(nèi)肽酶（GEP）4個亞家族。在生物體內(nèi)，這類酶可以調(diào)節(jié)生物活性肽及肽類激素的活性，參與很多重要的生理過程。在哺乳動物中與某些疾病息息相關(guān)，如健忘癥、抑郁癥、糖尿病和錐蟲病等。脯氨酰寡肽酶與脂酶

2、（Lipase）和酯酶（Esterase）類似，均有C-端α/β-水解酶催化結(jié)構(gòu)域，N-端β-螺旋結(jié)構(gòu)域可以調(diào)節(jié)活性部位的構(gòu)象。脯氨酰寡肽酶在哺乳動物中研究較多，但在昆蟲中研究較少。家蠶（B. mori），是由5000多年前的野桑蠶（B. mandarina）經(jīng)人工飼養(yǎng)馴化而來。隨著生物學(xué)的發(fā)展，家蠶作為鱗翅目的模式昆蟲，已被廣泛用于昆蟲的比較基因組學(xué)和遺傳學(xué)等方面的研究。近些年來，家蠶基因組序列公布后，越來越多的基因家族被鑒定，相關(guān)的

3、基因功能相繼被報道。但家蠶基因組中脯氨酰寡肽酶家族的信息及有關(guān)功能仍不清楚。
　　本文基于家蠶基因組序列、預(yù)測的蛋白質(zhì)庫和EST數(shù)據(jù)，通過比較基因組學(xué)、生物信息學(xué)分析對家蠶脯氨酰寡肽酶家族進(jìn)行鑒定、進(jìn)化分析以及表達(dá)模式分析，并對家蠶乙酰肽水解酶基因（BmAPH）進(jìn)行了克隆和功能分析，得到了如下主要結(jié)果：
　?、倩诩倚Q的預(yù)測蛋白質(zhì)庫，利用hmmsearch檢索，從家蠶基因組中鑒定出9個脯氨酰寡肽酶家族的候選基因，可以分為3個

4、亞家族，其中APH、POP這兩個亞家族均只有一個成員，DDP亞家族有7個成員。
　?、诨诤蜻x基因的核苷酸序列設(shè)計引物，通過RT-PCR對脯氨酰寡肽酶家族的候選基因進(jìn)行了表達(dá)模式分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)家蠶POP家族9個基因中8個有轉(zhuǎn)錄證據(jù)，Bm3和Bm5分別在幼蟲期和蛹后期及成蟲期高表達(dá)，Bm3在幼蟲中腸中高表達(dá)，Bm5和Bm7在頭、表皮、性腺中高表達(dá)。家蠶POP家族成員表達(dá)模式的差異為后續(xù)的功能研究提供了一定依據(jù)。
　?、弁ㄟ^5’

5、-RACE、3’-RACE以及RT-PCR從家蠶大造品系5齡3天整蠶材料中克隆獲得BmAPH基因的全長序列（GenBank登陸號：KR094958）。BmAPH基因的cDNA全長2751 bp，開放閱讀框（ORF）長2133 bp，5’-UTR長147 bp，3’-UTR長471 bp，可編碼含710個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，預(yù)測分子量和等電點分別為78,481 Da和6.31。該基因由14個外顯子和15個內(nèi)含子組成，內(nèi)含子的剪切邊界含有保

6、守的序列“GT-AG”。多序列比對，發(fā)現(xiàn)BmAPH含有乙酰肽水解酶的典型特征，如Ser566-Asp654-His686催化三聯(lián)體、含有活性位點絲氨酸殘基以及三個甘氨酸殘基的一致序列（G-X-S566-X-G-G）和形成氧離子穴的保守基序（HGGP）。
　?、軜?gòu)建原核表達(dá)載體BmAPH-pET28a，將BmAPH基因進(jìn)行外源誘導(dǎo)表達(dá)。通過摸索誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度以及誘導(dǎo)時間對外源蛋白表達(dá)形式的影響，從而得到了 BmAPH蛋白以可溶

7、形式表達(dá)的最佳條件。利用親和層析的方法純化含有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白，通過Western blotting以及Maldi-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定，確認(rèn)純化的蛋白確實是BmAPH基因的外源表達(dá)產(chǎn)物。
　?、萃ㄟ^RT-PCR檢測BmAPH基因的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BmAPH基因在被檢測的9個組織和23個發(fā)育時間點均有表達(dá)，且?guī)缀鯖]有組織或時期表達(dá)特異性。以純化的蛋白作為抗原免疫小鼠，制備多克隆抗體。以提取的大造5齡3天幼蟲的總蛋白作為抗原

8、，通過Western blotting驗證，結(jié)果表明制備的多克隆抗體是特異性的，可用于后續(xù)的實驗。對大造5齡3天幼蟲頭和中腸進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，結(jié)果表明 BmAPH存在于基膜中?；げ粌H對細(xì)胞、組織結(jié)構(gòu)起支持作用，同時也是滲透性的障礙，可調(diào)節(jié)分子和細(xì)胞的運動，一定程度上可使細(xì)胞或組織免受損傷。
　　⑥純化蛋白的酶活測定表明，BmAPH具有乙酰肽水解酶活性。通過測定不同反應(yīng)溫度或同一溫度下不同pH對酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)BmAPH活性

9、易受溫度和pH的影響，最適反應(yīng)溫度和最適pH值分別為50℃和7.7。分析三種有機磷殺蟲劑（毒死蜱、馬拉硫磷和辛硫磷）對BmAPH活性的影響，發(fā)現(xiàn)它們均能抑制BmAPH的活性。馬拉硫磷和辛硫磷對BmAPH活性的抑制中濃度 IC50分別為7.62 mg/L和7.90 mg/L，相對而言，毒死蜱對BmAPH活性的抑制程度更高，IC50為1.60 mg/L。同時，測定用有機磷殺蟲劑處理家蠶后整蠶和中腸中APH的活性。與對照相比，結(jié)果表明分別用殺

10、蟲劑處理家蠶后整蠶或中腸中APH的活性顯著地降低了。
　　綜上所述，從家蠶基因組中鑒定出9個脯氨酰寡肽酶家族候選基因，與其他物種脯氨酰寡肽酶家族基因進(jìn)行了比較分析，并從分子水平檢測了該家族基因在家蠶不同組織以及不同發(fā)育時期的表達(dá)模式，這為研究脯氨酰寡肽酶家族基因在家蠶及其他昆蟲中的潛在功能或進(jìn)化關(guān)系提供了一定依據(jù)。另外，對BmAPH進(jìn)行了克隆、表達(dá)模式、組織定位和酶活性分析，為研究其他昆蟲中乙酰肽水解酶的功能提供了有用信息。重要的