HLA-A33分子的體外表達(dá)及鑒定.pdf

1、人類(lèi)白細(xì)胞抗原（HLA）是一種重要的遺傳物質(zhì)，是目前所知人體最復(fù)雜的多態(tài)系統(tǒng)。在我國(guó)人群中A33表位占A位點(diǎn)表位的21％，是臨床中較常見(jiàn)的表位。根據(jù)近些年相關(guān)報(bào)道，HLA-A33表位在多種疾病的病程進(jìn)展過(guò)程中起著重要作用。在我國(guó)南方以及Korea統(tǒng)計(jì)的結(jié)果，HLA-A33與HBV感染后慢性化有較明顯的相關(guān)性；Luan-Yin Chang博士等的研究表明，HLA-A33型為EV71易感基因型；洪軍等人的研究表明，HLA-A33與小兒急性淋

2、巴細(xì)胞白血病有遺傳相關(guān)性（曹海霞等 2007）。本研究通過(guò)構(gòu)建HLA-A33表達(dá)載體，經(jīng)重組載體的鑒定、載體的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)染、目的蛋白的原核表達(dá)及表達(dá)水平的檢測(cè)，初步研究HLA-A33分子與EV71病毒分子之間的相互作用，為研究HLA-A33在相關(guān)疾病中的致病作用和免疫機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為兩部分：
　　 第一部分：建立穩(wěn)定表達(dá)HLA-A33分子的細(xì)胞系及其功能的相關(guān)研究。從GenBank查閱人類(lèi)HLA-A33的基因

3、序列，結(jié)合真核表達(dá)的特點(diǎn)，優(yōu)化所得序列的密碼子，并且添加必要的限制性酶切位點(diǎn)Nhe I、Xho I及Flag標(biāo)簽蛋白。通過(guò)四質(zhì)粒慢病毒系統(tǒng)將目的基因片段整合到宿主細(xì)胞的基因組DNA上。構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞系通過(guò)puro篩選可穩(wěn)定傳代的細(xì)胞，通過(guò)IF，WB，PCR等方法鑒定細(xì)胞系。用EV71病毒感染所獲得的穩(wěn)定細(xì)胞系，嘗試通過(guò)CoIP尋找HLA-A33與EV71之間存在相互作用的蛋白質(zhì)。
　　 第二部分：HLA-A33基因在原核細(xì)胞中表

4、達(dá)及檢測(cè)。根據(jù)原核表達(dá)的特點(diǎn)重新優(yōu)化密碼子，選擇pET28a作為表達(dá)載體，在序列兩端添加Nco I和BamH I限制性酶切位點(diǎn)，通過(guò)T4連接酶將載體和序列連接，化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，得到大量克隆并用PCR和測(cè)序鑒定目的基因的插入情況。將重組質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌柱BL21（DE3），通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)成像來(lái)檢測(cè)HLA-A33蛋白在原核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況。原核表達(dá)的蛋白添加了BirA

5、酶底物肽和鏈親和素標(biāo)簽Streptavidin，為后續(xù)構(gòu)建HLA-A33分子的tetramer四聚體提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 本研究取得了如下成果：用常用的分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建了HLA-A33的原核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)HLA-A33蛋白在原核細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)，并對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行了檢測(cè)分析；利用慢病毒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染法獲得了HLA-A33穩(wěn)定細(xì)胞系并利用穩(wěn)定細(xì)胞系初步進(jìn)行EV71與HLA-A33相互作用蛋白的分析。實(shí)驗(yàn)的成果對(duì)于HLA-A33的后續(xù)研