1，3-甘油二酯對(duì)2型糖尿病的影響及選擇性水解甘油三酯sn-2位酯鍵酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、2型糖尿病(T2DM)是一種世界性的流行性疾病，其患病率日益升高，且日趨年輕化。研究表明，T2DM與膳食脂肪攝入之間存在相關(guān)性。1，3—甘油二脂(1，3—DAG)是天然油脂的微量組成成分，以1，3—DAG替換膳食中的甘油三酯(TAG)，可以降低T2DM老鼠血清胰島素和瘦素的濃度，改善T2DM人群的血脂代謝。但1，3—甘油二酯的攝入是否可以改善T2DM患者葡萄糖代謝相關(guān)指標(biāo)，目前尚無(wú)大規(guī)模人體實(shí)驗(yàn)證實(shí)。天然油脂中1，3—DAG的含量極低，

2、需通過(guò)對(duì)現(xiàn)有油脂資源進(jìn)行改造而制備。目前在市場(chǎng)上銷(xiāo)售的富含1，3—DAG的食用油是采用化學(xué)法制備而成，不易為消費(fèi)者所接受，而利用脂肪酶制備1，3—DAG受到越來(lái)越多的關(guān)注。南極假絲酵母脂肪酶A(CAL—A)具有傾向性水解TAG sn—2位酯鍵的特性，可以利用其制備1，3—DAG。但該酶在原始菌株中產(chǎn)量極低。本學(xué)位論文擬調(diào)查1，3—DAG對(duì)T2DM的影響，并在外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)中對(duì)編碼CAL—A的基因進(jìn)行表達(dá)，利用表達(dá)的重組脂肪酶水解TAG

3、而制備1，3—DAG。
　　 本學(xué)位論文主要內(nèi)容分述如下：
　　 采用雙盲的、平行對(duì)照的膳食干預(yù)研究，評(píng)價(jià)1，3—DAG對(duì)T2DM的影響。共招募杭州地區(qū)127名40～65歲的T2DM受試者，隨機(jī)分成兩組，分別攝入等量DAG(1，3—DAG占64％)或TAG120天。分別在第0、60和120天測(cè)定受試者生理參數(shù)并采集血液樣品。采用商業(yè)化試劑盒對(duì)受試者的肝腎功能指標(biāo)、血脂代謝指標(biāo)、血糖濃度、血清胰島素和瘦素濃度進(jìn)行檢測(cè)：采用

4、氣相色譜法檢測(cè)受試者血清磷脂脂肪酸組成；胰島素抵抗指數(shù)(HOMA—IR)由以下公式進(jìn)行計(jì)算：HOMA—IR=空腹胰島素濃度×空腹血糖濃度/22.5。共有112名受試者完成本次實(shí)驗(yàn)，其中DAG組60人(36名女性，24名男性，平均年齡54.1±6.7歲)，TAG組52人(29名女性，23名男性，平均年齡53.9±6.0歲)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DAG組和TAG組受試者的體重均顯著下降(p＜0.05)，但DAG組的下降幅度(1.2 kg)顯著大于TA

5、G組的幅度(0.5 kg)(p＜0.05)。DAG組受試者的腰圍和臀圍顯著下降(p＜0.05)，TAG組的腰圍和臀圍未出現(xiàn)顯著變化。DAG組受試者的血清葡萄糖濃度由第0天的7.4 mmol/L下降至第120天的7.06mmol/L，而TAG組則由第0天的7.81mmol/L上升至第120天的7.88mmol/L，均未達(dá)到顯著水平。DAG組受試者的血清胰島素和瘦素濃度均明顯下降，但未達(dá)到顯著水平，而TAG組胰島素和瘦素濃度均顯著升高(p＜

6、0.05)。DAG組受試者的胰島素抵抗指數(shù)顯著下降(p＜0.05)，而TAG組的胰島素抵抗指數(shù)明顯升高，但未達(dá)到顯著水平。兩組之間肝腎功能相關(guān)指標(biāo)及血清磷脂必需脂肪酸組成無(wú)顯著差異。
　　 以南極假絲酵母基因組為模板，對(duì)編碼CAL—A的基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，然后與原核表達(dá)載體pET—28a連接構(gòu)建成重組載體，并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中。通過(guò)抗生素平板和PCR擴(kuò)增，篩選和鑒定重組子，并對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—

7、PAGE)顯示，重組脂肪酶以包涵體的形式存在。采用尿素處理后，未恢復(fù)其活性。
　　 將編碼CAL—A的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與酵母分泌型載體pPIC9K連接構(gòu)建成重組載體，并將其電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115中。通過(guò)最小葡萄糖培養(yǎng)基和最小甲醇培養(yǎng)基及PCR擴(kuò)增，篩選和鑒定重組子。重組酵母經(jīng)192h培養(yǎng)后，發(fā)酵液上清酶活達(dá)到17.4U/mL。SDS—PAGE顯示，重組脂肪酶分子量約為50kD。粗酶液經(jīng)中空纖維素膜超濾濃縮和離子柱交換層析后，得

8、到經(jīng)SDS—PAGE分析表明為單一條帶的重組脂肪酶。該酶最適反應(yīng)溫度為75℃：熱穩(wěn)定性高，在70℃及以下溫度保持30min后仍具90％以上的酶活性：最適反應(yīng)pH值為7.0，在pH6.0～8.0的范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性；Co2+和EDTA溶液對(duì)重組脂肪酶的活性具有促進(jìn)作用，Hg2+對(duì)脂肪酶活性具有抑制作用，Ca2+、Zn2+、Ag+等離子對(duì)脂肪酶的活性無(wú)顯著影響。
　　 將三油酸甘油酯與水以3：1(w：w)的比例混合，并加入占三油

9、酸甘油酯重量2％的重組脂肪酶，60℃200rpm反應(yīng)35h后，反應(yīng)體系中的1，3—DAG含量約為14％。采用短程蒸餾法除去反應(yīng)體系中的水、甘油、自由脂肪酸和甘油單酯后，最終產(chǎn)物中1，3—DAG的含量可以達(dá)到43％。
　　 本學(xué)位論文檢驗(yàn)了1，3—DAG對(duì)T2DM的影響。與TAG相比，1，3—DAG的攝入可顯著降低T2DM患者體重、體重指數(shù)、腰圍、臀圍、胰島素抵抗、血清胰島素和瘦素濃度等指標(biāo)；1，3—DAG可提供與TAG相同的必需