雙特異性磷酸酶12及二硫鍵形成蛋白A類似蛋白與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、研究目的： 研究雙特異性磷酸酶12和二硫鍵形成蛋白A類似蛋白基因單核苷酸多態(tài)性與糖尿病的關(guān)系，初步探討二硫鍵形成蛋白A類似蛋白在糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用。 (1)葡萄糖激酶是肝臟糖脂代謝的關(guān)鍵酶。葡萄糖激酶相關(guān)雙特異性磷酸酶12(DUSP12)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種表達(dá)于肝臟，能夠與葡萄糖激酶特異性結(jié)合并且催化其磷酸化的磷酸酶。編碼DUSP12的基因位于染色體1q21-23區(qū)域內(nèi)，有研究表明該區(qū)域有與2型糖尿病密切相關(guān)的遺傳關(guān)

2、聯(lián)位點(diǎn)。因此，DUSP12及其基因單核苷酸多態(tài)性是否可能與肝胰島素敏感性及糖尿病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)?本研究旨在探討DUSP12基因多態(tài)性與中國(guó)人2型糖尿病的關(guān)系。 (2)二硫鍵形成蛋白A(DsbA)類似蛋白(DsbA-L)與DsbA具有高度相似的蛋白質(zhì)一級(jí)和高級(jí)結(jié)構(gòu)，后者是一種具有催化分泌蛋白質(zhì)二硫鍵形成功能的強(qiáng)氧化酶。因此，DsbA-L很可能也具有催化二硫鍵形成的功能，并且已有研究發(fā)現(xiàn)DsbA-L可以增加高分子量脂聯(lián)素的分泌。成熟

3、胰島素有3個(gè)二硫鍵，與正常胰島素功能密切相關(guān)。這提示DsbA-L與胰島素的形成可能有關(guān)。本研究首先探討了DsbA-L基因與胰島素生物合成及分泌以及與2型糖尿病的關(guān)系。其次，本研究還在細(xì)胞水平上對(duì)DsbA-L蛋白的功能進(jìn)行初步研究。 研究對(duì)象與方法： (1)社區(qū)流行病學(xué)調(diào)查人群及醫(yī)院門診人群中選取577例上海地區(qū)中國(guó)人，其中糖耐量正常者359名，新診斷2型糖尿病患者218例；檢測(cè)目標(biāo)人群的身高、體重等人體測(cè)量學(xué)指標(biāo)，受試者

4、均進(jìn)行口服糖耐量試驗(yàn)(OGTT)，檢測(cè)糖脂代謝及胰島素水平等血漿或者血清參數(shù)，用MRI檢測(cè)受試者腹部皮下脂肪面積及腹內(nèi)脂肪面積，用生物電阻抗法檢測(cè)受試者體脂含量；用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶(PCR-RFLP)方法檢測(cè)DUSP12基因-6735T/C變異。 (2)隨機(jī)選取589名正常糖耐量者及556名2型糖尿病患者，并且進(jìn)一步按照BMI將兩組均分成正常體重亞組(BMI<24 kg/m2)和超重/肥胖亞組(BMI≥24 kg/m2

5、)；對(duì)受試者進(jìn)行人體測(cè)量學(xué)檢測(cè)及OGTT檢查，檢測(cè)血漿或者血清中的糖脂代謝相關(guān)指標(biāo)，檢查受試者腹部皮下及腹內(nèi)脂肪面積；測(cè)序檢測(cè)OsbA-L基因中8個(gè)外顯子及側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)遺傳變異位點(diǎn)；用PCR-RFLP法檢測(cè)OsbA-L基因SNP-1308G/T(rs1917760)變異位點(diǎn)。 通過(guò)Western Blot方法檢測(cè)MIN-6細(xì)胞中的DsbA-L經(jīng)不同糖濃度培養(yǎng)后的蛋白質(zhì)表達(dá)變化情況；在MIN-6細(xì)胞中過(guò)表達(dá)DsbA-L蛋白，觀察葡

6、萄糖刺激的胰島素分泌水平。 研究結(jié)果： (1)對(duì)DUSP12基因-6735T/C多態(tài)性與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)： 1.糖尿病組與正常糖耐量組間DUSP12基因-6735T/C多態(tài)位點(diǎn)各基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2.在正常糖耐量者中，此多態(tài)C等位基因攜帶者空腹血糖水平高于T/T基因型者[5.00(4.69-5.28)mmol/L VS4.90(4.50-5.26)mmol/L P=0.035]

7、：3.C等位基因攜帶者血清高密度脂蛋白膽固醇低于T/T基因型者(1.25±0.30mmol/L VS1.34±0.30mmol/L P=0.010)。 (2)對(duì)DsbA-L基因多態(tài)性與2型糖尿病關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)：1.DsbA-L基因序列在外顯子及側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)未見單核苷酸多態(tài)性變異位點(diǎn)；2.位于DsbA-L基因5’非編碼區(qū)的SNP-1308G/T(rs1917760)變異位點(diǎn)多態(tài)性頻率及等位基因頻率分布在正常糖耐量組和糖尿病組間及正常

8、體重和超重/肥胖亞組間均無(wú)顯著性差異；2.正常糖耐量及正常體重組中SNP-1308G/T(rs1917760)變異位點(diǎn)T等位基因攜帶者餐后胰島素分泌水平，包括第一相和第二相胰島素分泌，顯著高于非T等位基因攜帶者(P=0.007；P=0.031)。多元逐步回歸分析見到DsbA-L基因SNP-1308G/T(rs1917760)變異位點(diǎn)多態(tài)性在正常糖耐量及正常體重組中是第一相和第二相胰島素分泌的獨(dú)立相關(guān)因素(R2=0.055，P=0.007

9、；R2=0.029，P=0.041)；3.在正常糖耐量及超重/肥胖組中SNP-1308G/T(rs1917760)變異位點(diǎn)T等位基因攜帶者的腹內(nèi)脂肪面積顯著高于非T等位基因攜帶者(P=0.020)。 應(yīng)用小鼠胰島B細(xì)胞株MIN-6細(xì)胞研究高糖培養(yǎng)對(duì)DsbA-L蛋白質(zhì)表達(dá)的影響及DsbA-L對(duì)胰島素分泌的作用，結(jié)果見到：1.MIN-6細(xì)胞中DsbA-L蛋白表達(dá)水平隨著培養(yǎng)液中糖濃度的升高呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢(shì)，并且在高糖培養(yǎng)下

10、MIN-6細(xì)胞中DsbA-L蛋白表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)亦呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢(shì)；2.MIN-6細(xì)胞中DsbA-L過(guò)表達(dá)能增加MIN-6細(xì)胞葡萄糖刺激后胰島素分泌水平，在低濃度葡萄糖(3.3mM)刺激時(shí)過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組胰島素分泌量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013)。 結(jié)論： (1)DUSP12基因SNP-6735T/C(rs1027702)變異位點(diǎn)與2型糖尿病及胰島素抵抗參數(shù)無(wú)直接關(guān)聯(lián)，但是與糖脂代謝參數(shù)有一定相關(guān)性