海馬Rac1活性與場(chǎng)景恐懼記憶的維持及遺忘.pdf

1、目的:
　　研究海馬Rac1活性與場(chǎng)景恐懼記憶保持及遺忘的關(guān)系，探討PTSD病理性恐懼記憶不能遺忘的分子機(jī)制，為PTSD患者的治療提供新的理論指導(dǎo)。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)一:確定一個(gè)能誘導(dǎo)出相似學(xué)習(xí)曲線，但產(chǎn)生不同恐懼記憶的實(shí)驗(yàn)方案。成年健康雄性SD大鼠在條件恐懼操作箱內(nèi)接受5次電擊強(qiáng)度為0.5、0.8或1.2 mA的足底電擊，兩次電擊間隔時(shí)間為12s、122 s或600 s，24 h后進(jìn)行恐懼記憶的檢測(cè)。
　　

2、實(shí)驗(yàn)二:探討0.8 mA電擊強(qiáng)度學(xué)習(xí)后不同時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生的恐懼記憶及其與海馬Rac1活性的關(guān)系。動(dòng)物在條件恐懼操作箱內(nèi)接受5次電擊強(qiáng)度為0.8 mA的足底電擊，兩次電擊間隔時(shí)間為12s，122 s或600 s，1h、24 h或7d后進(jìn)行恐懼記憶的檢測(cè)，部分大鼠電擊結(jié)束后取材用于Rac-GTP的western blotting(WB)檢測(cè)及免疫組織化學(xué)(IF)染色。
　　實(shí)驗(yàn)三:探討Rac1的活性是否調(diào)節(jié)著大鼠的場(chǎng)景恐懼記憶。成年雄性S

3、D大鼠在條件恐懼操作箱內(nèi)接受5次足底電擊，兩次電擊間隔時(shí)間為12 s或122 s，12 s組大鼠電擊結(jié)束后立即雙側(cè)海馬CA1區(qū)予Rac1抑制劑NSC23677，122 s組大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)予Rac1激動(dòng)劑CN04-A后行足底電擊，24 h和（或）7天后進(jìn)行恐懼記憶的檢測(cè)。
　　實(shí)驗(yàn)四:探討場(chǎng)景恐懼記憶的消退與海馬Rac1活性的關(guān)系。成年雄性SD大鼠在條件恐懼操作箱內(nèi)接受5次足底電擊，24 h后在條件恐懼操作箱內(nèi)接受6次每次5

4、min的消退訓(xùn)練，兩次消退訓(xùn)練間隔時(shí)間為0 min，10 min或30 min，消退結(jié)束后24 h和16d進(jìn)行恐懼消退的檢測(cè)。部分大鼠消退結(jié)束后1h取材用于WB或IF。
　　實(shí)驗(yàn)五:探討Rac1活性是否直接調(diào)節(jié)場(chǎng)景恐懼記憶的消退。成年雄性SD大鼠在條件恐懼操作箱內(nèi)接受5次足底電擊，24 h后在條件恐懼操作箱內(nèi)接受6次每次5 min消退訓(xùn)練，兩次消退訓(xùn)練無(wú)間隔，消退訓(xùn)練結(jié)束后立即雙側(cè)海馬CA1區(qū)予Rac1抑制劑NSC23677，24

5、 h和16d后進(jìn)行恐懼記憶的檢測(cè)。
　　實(shí)驗(yàn)六:進(jìn)一步探討Rac1活性是否調(diào)節(jié)著場(chǎng)景恐懼記憶的消退。成年雄性SD大鼠在條件恐懼操作箱內(nèi)接受5次足底電擊，24 h后接受6次每次10 min的強(qiáng)消退訓(xùn)練，兩次消退訓(xùn)練間隔時(shí)間為0 min，10 min或30 min，消退結(jié)束后24 h和16d進(jìn)行恐懼記憶的檢測(cè);部分大鼠消退結(jié)束后1h取材用于WB或IF。
　　結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)一:0.5mA電擊強(qiáng)度學(xué)習(xí)后，三組大鼠（12 s，

6、122 s和600 s）24小時(shí)恐懼記憶檢測(cè)無(wú)明顯差異，0.8 mA或1.2 mA電擊強(qiáng)度學(xué)習(xí)后，122 s和600 s組大鼠表現(xiàn)為場(chǎng)景恐懼記憶增強(qiáng)，與12 s組比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，此結(jié)果顯示0.8mA符合我們的實(shí)驗(yàn)要求。
　　實(shí)驗(yàn)二:學(xué)習(xí)后1小時(shí)恐懼記憶檢測(cè)結(jié)果顯示122 s和600 s組大鼠恐懼記憶明顯強(qiáng)于12 s組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;24h、7d恐懼記憶檢測(cè)結(jié)果類似1h，122 s和600 s組大鼠恐懼記憶顯著強(qiáng)于12 s組。W

7、estern blot檢測(cè)結(jié)果顯示條件恐懼學(xué)習(xí)后0h時(shí)間點(diǎn)三組大鼠海馬Rac1-GTP的表達(dá)與正常對(duì)照大鼠相似;1h時(shí)間點(diǎn)間隔學(xué)習(xí)組（122 s和600 s組）大鼠海馬Rac1-GTP的表達(dá)顯著下調(diào)，其中122 s組低于600 s組，集中學(xué)習(xí)組(12s) Rac1-GTP的表達(dá)類似正常組;24h時(shí)間點(diǎn)間隔學(xué)習(xí)組（122 s和600 s組）大鼠海馬Rac1-GTP的表達(dá)仍下調(diào)，但與正常對(duì)照相比未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，集中學(xué)習(xí)組Rac1-GTP的表

8、達(dá)類似正常組。免疫熒光染色結(jié)果顯示正常大鼠Rac1-GTP的染色主要分布于神經(jīng)元的胞膜和突起，可見(jiàn)Rac1-GTP陽(yáng)性的膠質(zhì)細(xì)胞及中間神經(jīng)元。集中學(xué)習(xí)組海馬CA1區(qū)Rac1-GTP的染色類似正常組，間隔學(xué)習(xí)組（122 s和600 s組）CA1區(qū)神經(jīng)元Rac1-GTP染色明顯減弱。此結(jié)果顯示間隔學(xué)習(xí)誘發(fā)海馬Rac1活性下調(diào)及強(qiáng)的場(chǎng)景恐懼記憶。
　　實(shí)驗(yàn)三:24h恐懼記憶檢測(cè)結(jié)果顯示予Rac1抑制劑(12 s+NSC)組大鼠恐懼記憶明

9、顯強(qiáng)于予生理鹽水(12 s+sal)組，達(dá)到122 s組水平，差異具有顯著性，7d再次檢測(cè)結(jié)果類似24 h。恐懼學(xué)習(xí)后7d第一次行恐懼記憶檢測(cè)的結(jié)果同樣顯示Rac1抑制劑(12 s+NSC)組大鼠恐懼記憶明顯高于生理鹽水對(duì)照(12 s+sal)組，達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;Rac1激動(dòng)劑CN04-A(122 s+CN04-A)組大鼠24 h恐懼記憶檢測(cè)顯著低于生理鹽水對(duì)照組(122 s+sal)，7d再次檢測(cè)結(jié)果類似24 h。此結(jié)果顯示調(diào)節(jié)海馬Ra

10、c1活性可調(diào)節(jié)大鼠場(chǎng)景恐懼記憶的強(qiáng)弱。
　　實(shí)驗(yàn)四:結(jié)果顯示0 min組（集中消退）恐懼消退訓(xùn)練時(shí)成績(jī)明顯優(yōu)于10 min和30 min組（間隔消退），消退訓(xùn)練后24 h檢測(cè)結(jié)果顯示三組大鼠(0 min、10 min、30 min)恐懼記憶均出現(xiàn)明顯消退，組間無(wú)差異;消退后16d再次檢測(cè)結(jié)果顯示0 min組大鼠恐懼記憶進(jìn)一步降低，10 min組部分恢復(fù)，30 min組幾乎完全恢復(fù)，三組間達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。WB檢測(cè)結(jié)果顯示0 min組大

11、鼠海馬Rac1-GTP表達(dá)顯著上調(diào)，30 min組輕度下調(diào);免疫熒光染色結(jié)果顯示0 min組大鼠海馬CA1區(qū)Rac1-GTP染色增強(qiáng)，30min組染色減弱。此結(jié)果顯示集中消退促進(jìn)大鼠海馬Rac1的激活及明顯的場(chǎng)景恐懼記憶消退。
　　實(shí)驗(yàn)五:24 h恐懼消退結(jié)果顯示Rac1抑制劑(0 min+NSC)組大鼠恐懼記憶高于生理鹽水組(0 min+sal)，但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，16d再次檢測(cè)結(jié)果顯示Rac1抑制劑(0min+NSC)組大鼠恐

12、懼記憶明顯高于生理鹽水(0 min+sal)組，兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此結(jié)果顯示抑制海馬Rac1的激活清楚了集中消退誘發(fā)的場(chǎng)景恐懼記憶較弱效應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)六:結(jié)果顯示0 min組（集中消退）大鼠消退訓(xùn)練時(shí)消退成績(jī)明顯優(yōu)于10 min和30 min組（間隔消退），消退訓(xùn)練后24 h檢測(cè)結(jié)果顯示三組大鼠(0 min、10 min、30 min)恐懼記憶均出現(xiàn)明顯消退，其中10 min組略高于0min組和30 min組，但組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差

13、異;消退后16 d檢測(cè)結(jié)果顯示三組大鼠的恐懼記憶均出現(xiàn)明顯消退。WB檢測(cè)結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相比，0 min和10 min組大鼠海馬Rac1-GTP的表達(dá)均上調(diào)，其中0 min組達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。免疫熒光染色顯示0 min和10 min組大鼠海馬CA1區(qū)Rac1-GTP染色均增強(qiáng)，30 min組染色與正常對(duì)照組相似。此結(jié)果顯示促進(jìn)海馬Rac1活性的恢復(fù)促進(jìn)了場(chǎng)景恐懼記憶的消退。
　　結(jié)論:
　　抑制海馬Rac1活性導(dǎo)致大鼠場(chǎng)景恐